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Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Gansu Lanzhou730000，China
【Abstract】 Objective To discuss preventing and treating effect on rat model of pulmonary fibrosis by Lifei Huaxi-an prescription.Methods Reproducing rat model of pulmonary fibrosis by injecting bleomycin to trachea，then treat the rat models by Lifei Huaxian prescription，and observe the prescription's effect on the target of pulmanory index and pulmanory pathology.Results The decoction can depresses pulmanory index（P<0.05），reduces degree of pul-monary alveolitis and fibrosis（P<0.05）.Conclusion LiFeiHuaXian prescription have effect on preventing and treating the model of pulmanary fibresis reproduced by bleomycin.
【Key words】 Lifei Huaxian prescription;pulmanary fibrosis
肺间质纤维化（肺纤维化）为一组病因各异，表现相似的疾病谱，是多种弥漫性肺间质疾病的一种病理改变，是对损伤的过度修复。本病对人类健康危害极大，目前发病机制尚不十分明确，临床治疗效果不佳 ［1］。在中医传统著述中，没有与肺纤维化完全对应的病名，后世医者根据其临床表现将其归为“喘证”“痰饮”“咳嗽”“肺痿”“肺胀”“肺痹”“短气”等疾病范畴。临床症状多因肺气郁闭，血络阻滞，湿饮停聚三者互结所致，治疗当以宣肃肺气，活血通络，利湿化饮为主，根据此治疗原则，通过理肺化纤方（LFHX）即升降散（僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄）合理加用葶苈子、白芥子等药，进行复方研究，补充了中医经方防治肺纤维化的空白。本研究从形态学角度出发，旨在观察LFHX对博莱霉素大鼠肺纤维化的作用，从细胞水平探讨其作用机制，为临床防治肺纤维化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SD大鼠60只，雌雄各半，体重250±20g，购自青海省实验动物中心，动物合格证号第零零壹号。
1.1.2 药品 LFHX煎剂:生药由甘肃中医学院附属医院药剂科提供，加水浸泡1h后煮沸30min，滤过取汁，再加水煎煮30min，滤过取汁。水浴浓缩为每毫升含1g生药，备用。博莱霉素:日本化药株氏会社，生产批号:Y32480，以无菌生理盐水稀释成2.5mg/ml的溶液，备用。强的松:浙江仙据制药股份有限公司，生产批号:030629，研成粉末，以蒸馏水溶解配成25%的混悬液，备用。
1.1.3 仪器 MP120-2型扭力天平（分度值:0.1mg，上海第二天平仪器厂）、CH型普通光学显微镜（日本OLYM-PUS）、BX60-32-FB3-F01显微照相系统（日本OLYM-PUS）、JEM-1230电子显微镜（日本电子株氏会社）
1.2 方法
1.2.1 动物分组 将购置大鼠分笼，喂标准颗粒饲料，自由饮水，在室温22±5℃，湿度75%，通风的条件下适应2天后按体重编号，依据随机数字表法分为5组，每组12只，雌雄各半。5组分别为:空白对照组，模型组，强的松对照组、LFHX治疗组、强的松加LFHX治疗组。
1.2.2 建立动物模型 各组大鼠分别用乙醚麻醉，仰卧于固定台上，固定头部及四肢，切开颈部皮肤，分离皮下组织，模型组、强的松对照组、LFHX治疗组、强的松加LFHX治疗组动物于气管软骨环之间穿刺一次性缓慢注入博莱霉素溶液，剂量为5mg/kg;空白对照组动物于气管软骨环之间穿刺，一次性缓慢注入生理盐水（2ml/kg）。然后立即将动物直立旋转，尽量使药液在肺内分布均匀。
1.2.3 给药 强的松组在造模第2日开始治疗给强的松灌胃（0.56mg/kg），LFHX治疗组在造模第2日开始治疗给LFHX煎剂灌胃（剂量为成人等效量4g/kg），强的松加LFHX治疗组给药为上述两组的合剂。空白对照组和模型组给等容积温开水，均连续灌胃28天。
1.2.4 标本采集及制备 末次给药后2h全部杀检。肺组织制备:光镜:将右肺中叶取下，福尔马林固定。电镜:将右下肺靠外侧取1mm×1mm×1cm大小肺组织行戊二醛、锇酸双固定。
1.2.5 主要观察指标及方法 肺指数=肺重/体重肺组织形态学:①HE染色、Masson染色，普通光镜下观察各组肺组织形态学特征，依据Szaipil等 ［2］ 方法将肺泡炎及肺纤维化程度分级:HE染色切片将肺泡炎程度分为-～+++级，Masson染色将肺纤维化程度分为-～+++级。②透射电镜观察。
1.2.6 统计学处理 计量资料采用单因素方差分析，两两作LSD-t检验，用均数±标准差（ˉx±s）表示;等级资料各组间比较采用非参数秩和检验。P<0.05有统计学意义。数据采用SPSS11.0统计软件处理。
2 结果
2.1 肉眼观察 空白对照组大鼠体重逐渐增重，活动良好，反应灵敏，双肺呈淡粉色，表面光滑，模型组大鼠精神萎靡、活动减少，反应迟钝，双肺体积略小，可见小片状凹凸不平的苍白灶，LFHX组，强的松组，LFHX加强的松组大鼠双肺未见明显异常改变。
2.2 各组动物肺指数的比较 见表1。
2.3 光镜观察 肺组织切片经HE及Masson染色分别显示肺泡炎及肺纤维化程度。
HE染色切片中空白对照组肺组织结构清晰，毛细血管正常，肺泡腔完整，有少数肺组织近胸膜处单核细胞数量较多。模型组肺组织中可见大面积肺间质中单核细胞浸润，肺泡间隔明显增厚，毛细血管明显增生，病变部位广泛，少数肺组织肺泡腔中亦有单核细胞浸润、大面积出血、部分肺泡呈囊状扩张。强的松对照组、LFHX治疗组、强的松加LFHX治疗组病变主要为肺泡间隔的增宽，极个别肺组织中见到肺泡腔中有单核细胞浸润及出血，程度均较模型组轻（见图1、图2）。
表1 各组动物肺指数的比较 （略）
注:与空白对照组比较， △ P<0.05，与模型组比较， * P<0.05
Masson染色切片中空白对照组肺泡结构正常。模型组可见大面积大量胶原纤维沉积呈束状而造成肺泡壁明显增厚及肺泡形态改变。强的松对照组、LFHX治疗组、强的松加LFHX治疗组主要病变为肺泡壁的增厚，有少量胶原纤维沉积（见图3、图4）。
各组动物病理变化程度比较见表2。
表2 各组动物病理变化程度比较（略）
注:与模型组比较， * P<0.05
2.4 电镜观察 空白对照组肺泡上皮结构完整，Ⅰ型上皮细胞胞质扁平，其基膜与毛细血管基膜贴敷紧密，由肺泡表面活性物质、肺上皮细胞及其基膜、间隙、血管内皮细胞及其基膜组成的整个呼吸膜连续、较厚;Ⅱ型细胞形态正常，表面具有绒毛，内含嗜锇性分泌颗粒，为板层状;细胞间连接比较紧密，间质中有少量纤维，排列松散而稀疏。模型组肺组织整体结构比较疏松，呼吸膜出现分层、扭曲甚至破坏;Ⅱ型细胞绒毛减少甚至消失，板层小体大部分缺失呈空泡状;肺间质大量纤维堆积，排列紧密而凌乱。强的松对照组，LFHX治疗组，强的松加LFHX治疗组呼吸膜偶见分层或扭曲，连续性良好;Ⅱ型细胞绒毛基本正常，板层小体有较多残留，肺间质存在少量纤维（见图5、图6、图7、图8）。
3 讨论
LFHX主方为升降散。升降散由僵蚕、蝉蜕、姜黄、大黄、蜂蜜、米酒组成。用药仅六味，但选药精当、用药轻灵、药少力专。清代医家杨栗山在所著《伤寒瘟疫条辨》中强调了升降散的重要性，称其为治疗瘟疫15方的总方。由于其组方精当、疗效显著，临床上被广泛应用。鉴于升降散方中祛痰药力偏小，故在本方中酌加葶苈子和白芥子。
本实验中模型组大鼠体重减轻，肺重增加，肺指数明显上升，光镜下见肺泡壁明显增厚，单核细胞浸润至肺泡腔及肺间质，成纤维细胞大量增生，而LFHX治疗组肺泡炎及肺纤维化的范围和程度均较模型组减轻，肺指数下降，表明LFHX对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化确有防治作用，机制之一可能是其通过一定程度地抑制炎性细胞浸润，减少炎性渗出物，阻止肺泡合成和释放大量具有多种生物活性细胞因子、前炎症介质、趋化因子及蛋白酶类等，从而抑制了成纤维细胞在损伤区的积聚、分化和增殖。
肺泡正常Ⅰ型细胞为扁平胞质，与血管内皮细胞及基膜组成气血屏障，保证气体的有效交换;肺泡Ⅱ型细胞中具有嗜锇性板层小体，内含磷脂和蛋白质等物质，以胞吐的形式被释放出即为肺泡表面活性物质，其有重要的生理意义:（1）降低肺泡表面张力、增大肺顺应性，可减少扩张肺所需做的呼吸功;（2）减少肺组织液的生成，防止肺水肿;（3）稳定肺泡回缩压，增加肺泡的稳定性。在本实验中透视电镜的观察结果发现模型组上皮细胞基膜完整性遭到破坏，胶原纤维大量堆积，Ⅱ型细胞中嗜锇性板层小体基本缺失，呈空泡样，而LFHX治疗组呼吸膜基本完整，胶原纤维沉积不明显，Ⅱ型细胞中嗜锇性板层小体有不同程度的残留。据此可知，LFHX可能是通过保护肺泡细胞或减轻肺泡细胞及呼吸膜的损伤，从而限制成纤维细胞增生及胶原的合成。另外LFHX可能通过对Ⅱ型细胞的保护，阻止肺纤维化时嗜锇性板层小体的流失，防止肺泡表面活性物质的减少，从而提高肺泡顺应性，减少渗出，减轻症状。
本实验还提示LFHX其在临床上不但可用于肺纤维化的防治，还可用于防治癌症患者使用博莱霉素后产生的肺毒性，可作为强的松的替代药物，避免其严重的副作用，减轻临床症状，改善生活质量，延长生存时间。实验中本方合用强的松时未见二者具有明显的协同作用，可避免临床上 药物的重复使用。
（本文图片见附页1，2）（略）
【参考文献】
1 Hunninghake GW，Kalica AR.Approaches to the treatment of pulmonary fibrosisJ.Am J Care Med，1995，151:915.
2 Szaipil SV，Elson NA，Fulmer JD.Bleomycininduced interstitial pul-monary disease in the nude，athymic mouse.Am Rer Respir Dis，1979，120:893.
作者单位:730000甘肃兰州，甘肃中医学院