乙酸乙酯萃取番石榴叶提取物抗菌作用的研究

　　【摘要】 目的  探讨乙酸乙酯萃取番石榴叶提取物的抑菌作用。 方法  应用琼脂打孔扩散试验和试管稀释法，分别测定番石榴叶的提取物对实验菌的抑菌效果，对三种细菌检测最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）。 结果  提取物对实验菌分别有不同程度的抑菌作用，其中对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果最明显，抑菌圈均为17.5mm，MIC为62.5mg/ml和250mg/ml，MBC为31.25mg/ml和125mg/ml，白色念珠菌的抑菌圈为15.5mm，MIC为125mg/ml、MBC为62.5mg/ml。 结论  乙酸乙酯萃取番石榴叶的提取物具有较强的抗菌作用。
　　
　　【关键词】  番石榴叶;抑菌作用;最小抑菌浓度（MIC）
      
　　番石榴叶为桃金娘科植物番石榴Psidium guajava L.的干燥叶，中医认为其性平、味干涩，功用收敛止泻，消炎止血，主治泄泻、创伤出血等。此外还含有大量鞣质及少量挥发油、石榴苷、扁蓄苷、槲皮素等，挥发油具有抗菌抗病毒作用，对消化系统也有解痉、增强胃肠蠕动的作用 ［1］ 。现代药理研究表明，番石榴叶有抗金黄色葡萄球菌以及有抗轮状病毒的作用，浸膏有降血糖的作用 ［2］ 。其抗轮状病毒的研究近几年在国内外都是一个热点，相关的报道也比较丰富，但是其抗菌作用的系统研究目前在国内外还不多，抗菌谱也不明确，抗菌的机制也还不大清楚，缺乏番石榴叶的抗菌性能及抗菌谱方面的科学数据，至今为止尚未有相关报道。
   
　　本课题以几种常见的致病细菌和真菌为代表，研究番石榴叶的抗菌作用，借以探讨其在中药中的应用范围，为番石榴叶的药用提供参考依据。

　　1 材料和方法
    
　　1.1 番石榴叶提取物的制备 将番石榴叶鲜叶洗净、晒干，放入烘箱烘烤后粉碎，用石油醚浸泡脱脂3次，每次24h，脱脂后的叶子加入适量水提取二次，提取液蒸发、浓缩、过滤后取上清加入乙酸乙酯溶剂萃取，将提取物的溶液烘干制成干粉（萃取的番石榴叶干粉均由杭州市中药研究所提供）。实验时以50%乙醇稀释成不同的浓度。将提取物称取1.000g加入10ml50%乙醇溶液加塞置4℃冰箱浸泡过夜，取出再置80℃水浴热浸4h，缩成1g/ml的番石榴叶提取物，置冰箱备用。
   
　　1.2 实验菌株 试验用菌株共11种，有金黄色葡萄球菌（菌号25923）、大肠杆菌（菌号25922）、枯草芽胞杆菌（菌号63501）、普通变形杆菌（菌号49005）、痢疾杆菌（菌号51253）、绿脓杆菌（菌号10102）、伤寒杆菌（菌号50097）、白色念珠菌（菌号10231）、乙型副伤寒杆菌（菌号0001）、脑膜炎双球菌（菌号29018）、乙型链球菌（菌号32210）11种菌株，均由北京生物制品研究所提供。
   
　　1.3 营养琼脂培养基 由浙江微生物研究所提供的成品，批号（20030506）临用前按使用说明书制备。
   
　　1.4 肉汤培养基的制备 以常规方法制备肉汤培养基，采用日本多价蛋白胨，肉膏量为0.5%。
   
　　1.5 血琼脂平板的制备 营养琼脂培养基（按使用说明书配制），冷至50℃左右加入7%～8%绵羊RBC（脱纤维羊血）。
   
　　1.6 供试菌悬液的制备 将各种供试细菌在营养琼脂斜面上进行35℃传代培养24h，每种细菌挑取1环，用10ml无菌生理盐水制成菌悬液，浊度为10 6 cfu/ml。稀释好的菌液均在15min内接种。

　　2 抑菌试验
    
　　采用平板打孔药敏法 ［3］ ，于直径9cm灭菌培养皿中分别加入10 6 cfu/ml菌液1ml，每种细菌加入1个平皿，然后注入已溶化冷却至45℃～50℃的营养琼脂培养基20ml（脑膜炎双球菌、乙型链球菌在无菌平皿中加入血琼脂培养基20ml），立即旋转混匀，待琼脂凝固后，用外径6mm的灭菌不锈钢打孔器在培养基上打2个等距离的孔，再用滴管吸取溶化的琼脂培养液，每孔滴入1滴，作补孔用，以免底部漏液。用微量加样器吸取50μl乙酸乙酯溶剂提取的番石榴叶提取液加入孔内，用50%乙醇溶液作空白对照，置35℃培养箱培养24h（脑膜炎双球菌用烛缸法培养）。量取抑菌圈直径（抑菌圈直径以mm计），实验重复2次，以2次平均值为抑菌圈直径，结果见表1。
    
　　表1 乙酸乙酯萃取番石榴叶的提取液对11种细菌的抑菌效果（略）
    
　　注:以上结果为二次实验的平均值。数值为抑菌圈直径;“6”为无抑菌圈。实验温度为20℃～22℃，菌悬液的浓度为10 6 cfu/ml，结果为2次试验平均值。

　　2.1 最小抑菌浓度（MIC）测定和最小杀菌浓度（MBC）测定 将乙酸乙酯溶剂提取的番石榴叶提取液（相当原液1g/ml的量）逐步降低浓度，和等量的双倍浓度的营养肉汤相混合，番石榴叶提取液的浓度为500mg/ml、250mg/ml、125mg/ml、62.5mg/ml、31.25mg/ml，每个浓度设3个平行管，并分别设不含番石榴叶提取液的肉汤培养基为对照管。然后用0.1ml浓度为10 6 cfu/ml实验菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌）接种各试管中，置35℃培养箱培养24h，再将每一浓度用接种环取一环划线接种于3等份的固体营养琼脂平板上，每个浓度做2个平行样品，于35℃24～48h培养观察结果，以抑制细菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC），以未见菌落生长的最低番石榴叶浓度为最小杀菌浓度（MBC） ［4］ 。对照组中未加番石榴叶提取液，故应长菌。本实验为3次或2次结果相同为准。结果见表2。
    
　　表2 乙酸乙酯萃取番石榴叶的提取液不同浓度抑菌效果测定（略）
    
　　注:“-”表示转种营养琼脂平板后无细菌作用;“+”表示转种营养琼脂平板有细菌作用。
    
　　3 结果
    
　　乙酸乙酯溶剂提取的番石榴叶萃取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有较强抑菌作用，抑菌圈均为17.5mm，MIC为62.5mg/ml、250mg/ml，MBC为31.25mg/ml、125mg/ml，白色念珠菌的抑菌圈为15.5mm，MIC为125mg/ml、MBC62.5mg/ml。
    
　　4 讨论
    
　　表1、2实验结果说明，乙酸乙酯溶剂萃取的番石榴叶提取液对11种常见细菌均有不同程度的抗菌作用，尤其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抗菌效果最好，抑菌圈均为17.5mm，对其它几种细菌均显示出较强的抑菌作用，抑菌圈为12.5～15mm不等。对金黄色葡萄球MIC62.5mg/ml、MBC为31.25mg/ml，大肠杆菌的MIC为250mg/ml、MBC为125mg/ml，白色念珠菌的MIC为125mg/ml、MBC62.5mg/ml。番石榴叶具有抗菌消炎功效，其提取液对受试的3种细菌的MIC、MBC均较低，具有较强的作用，尤其是对其他抗菌药物有耐药性的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等有较强的抗菌活性。本文研究结果证明番石榴叶具有较强的抗菌作用，为进一步开发利用提供了科学依据。

　　【参考文献】
    
　　1 魏练波，吕瑞和，陈宝田.番石榴叶体外抗轮状病毒的实验研究.国外医学·微生物分册，1996，3:3.
   
　　2 谢宗万.全国中草药汇编（上册）.北京:人民卫生出版社，1996，882.
   
　　3 扬履渭，刘秉阳.微生物学及检验技术（细菌对药物敏感试验）.广州:广东科技出版社，1992，440-447.
   
　　4 扬华明，易滨.现代医院消毒学.北京:人民军医出版社，2002，316-317.

　　* 基金项目:杭州师范学院科研基金项目（No.:2004XYM02）
   
　　作者单位:310018浙江杭州，杭州师范学院基础医学部形态中心实验室