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Home医源资料库在线期刊中华实用医药杂志2005年第5卷第15期

骨质疏松症骨吸收活性的动态测定

来源:中华实用医药杂志
摘要:随着人类寿命的延长,骨质疏松症(OP)已成为广泛日益关注的公共健康问题,并带来巨大的社会和经济负担。破骨细胞(OC)数量增多及其骨吸收活性增强是骨质疏松症骨量丢失的一个重要方面,本实验在体外破骨细胞连续培养的基础上采用骨片吸收陷窝光镜计数及面积测定法综合定量破骨细胞骨吸收功能,可以在细胞水平早期诊断O......

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     随着人类寿命的延长,骨质疏松症(OP)已成为广泛日益关注的公共健康问题,并带来巨大的社会和经济负担。破骨细胞(OC)数量增多及其骨吸收活性增强是骨质疏松症骨量丢失的一个重要方面,本实验在体外破骨细胞连续培养的基础上采用骨片吸收陷窝光镜计数及面积测定法综合定量破骨细胞骨吸收功能,可以在细胞水平早期诊断OP,并有助于分型、指导治疗,同时对疗效进行客观评价。

  1 材料与方法

    1.1 动物 一日龄SD大鼠50只,雌雄各半。

    1.2 实验材料 PBS(磷酸缓冲液),199培养基(GIBCO),胎牛血清(GIBCO),小牛血清(华美公司),1%甲苯胺蓝液,锯式切片机,超声波清洗仪(Japan),Luzex-F型图像分析仪(Japan)。

    1.3 薄骨片制备与处理 取直径20mm的象牙经锯式切片机切成50μm厚5mm×5mm大小骨片,蒸馏水中超声清洗,紫外线消毒后存放备用。

    1.4 破骨细胞分离和培养 新生SD大鼠经75%酒精浸泡消毒5min,拉颈处死后分离四肢长骨,仔细清除附着于骨表面的软组织和骨髓,骨干部分用PBS清洗后放入盛有15%199培养液(含10%小牛血清、5%胎牛血清、100μg/ml硫酸链霉素、100u/ml青霉素钠,pH7.2)的玻璃平皿中,用解剖刀将骨质内表面轻刮入培养液,再用圆头吸管反复吹打骨质碎片2min,静置30s后将上层细胞悬液(细胞密度5×10 6 /ml)均匀接种于预置薄骨片的24孔培养板内(每孔4片,每组4孔,共80张骨片),每孔分别加入破骨细胞悬液1ml及含血清的细胞培养液1ml,常规培养30min,用PBS冲掉未贴壁细胞,更换培养液,继续培养,培养液每天换1次。

  1.5 骨片吸收陷窝计数及吸收陷窝面积测定 分离培养24h后取出16张骨片(第1组),以后每24h取出16张骨片,连续5天(每1天作为1组),2.5%戊二醛固定7min,0.25M氢氧化胺超声清洗5min×3次,系列酒精脱水,自然晾干,1%甲苯胺蓝染液室温染色3~4min,蒸馏水清洗后光镜下观察破骨细胞性吸收陷窝形态,100倍下对每张骨片做陷窝计数,结果以陷窝数/骨片表示,同一张骨片同时随机选取10个视野,利用Luzex-F型图像分析系统对骨片进行吸收陷窝面积测定。

  1.6 统计学分析 数据以ˉx±s表示,各组吸收陷窝数与吸收陷窝面积之间做线性相关分析。

  2 结果

    2.1 骨片吸收陷窝的形态特征 取培养3天的骨片经甲苯胺蓝染色后在光镜下观察,可见吸收陷窝呈紫蓝色圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态、大小不等,深浅不一,边界清楚,陷窝底纤维纹路隐约可辨。

    2.2 骨片吸收陷窝计数及吸收面积测定 骨片上吸收陷窝数与吸收面积测定结果见表1,相关分析(r=0.967,P<0.01)。二者以各时限增长值(即该天与前天测定值的差值)与第1天基础值之比(吸收速率比)作为统一单位进行比较(见图1) 表1 吸收陷窝数(个)与吸收面积(mm 2 )(略)
   
  注:骨片吸收陷窝数和吸收陷窝面积测定结果完全相关(P<0.01),可共同评价破骨细胞功能图1 吸收速率比随培养时间的变化二者比较可以看出:(1)吸收陷窝数及吸收陷窝面积均随着培养时间的延长而增加,但增加速率并不均一,随着培养破骨细胞的活化、成熟及凋亡过程呈现出早期增加明显经过一个平台期之后晚期逐渐减少的趋势;(2)3天时吸收陷窝数及吸收面积均明显增加,说明存在大量成熟OC,活力强,形成陷窝面积较大;(3)4天时吸收陷窝数增加较小而吸收陷窝面积增加较大,提示增殖分化的细胞较少,以原来即存在的OC继续吸收移动为主;(4)5天时吸收陷窝个数增加明显而面积增加较少,表明不断分化成熟的细胞开始大量出现,但活性较弱,吸收能力较差,形成陷窝的面积亦较小。

  3 讨论

    在评价OC的骨吸收功能方面,骨片上吸收陷窝是OC骨吸收的直接结果,其陷窝数量、大小和深度直接反应OC骨吸收的能力 [1,2] 。应用体外培养技术,OC可在牛皮质骨片或象牙上形成吸收陷窝,观察陷窝的形态和测量陷窝的数量、大小是检测OC骨吸收功能的可靠指标 [3] 。本实验应用骨吸收陷窝计数光镜法和吸收陷窝面积测定法动态定量检测OC骨吸收功能,具有以下优点:(1)简便可靠,比传统扫描电镜计数更经济,有利于推广。(2)对骨吸收功能进行点面结合,交叉综合测定,更精确的量化OC功能。(3)动态检测,对比观察,即描绘了OC功能随时间的变化曲线也反应了OC分化、成熟过程及OC数目与吸收功能的关系,因而可以对骨质疏松症进行早期诊断、分型,并指导不同时期采用药物干预OC活性,同时进行疗效评价,可以在此基础上采用人骨髓OC培养而进一步应用于临床。即破骨细胞功能明显活跃,吸收陷窝数目增多且吸收面积同时明显增大,为高转换型骨质疏松症(Ⅰ型),治疗上应以抑制骨吸收为主,适当促进骨形成,进而改善骨重建;破骨细胞性骨吸收陷窝数目增多,但分化成熟的破骨细胞少见,陷窝吸收面积增多不明显,为低转化型骨质疏松症(Ⅱ型),治疗上应以促进骨形成为主。测定结果同时表明在破骨细胞性骨吸收早期。中期新增殖分化的破骨细胞尚未出现时即开始用药可达到较理想效果。与临床常用的骨质疏松症诊断指标(骨密度、生化指标)相比,此方法是从疾病的直接病因入手,在破骨细胞功能活跃的早期即可明确诊断,结果可靠,有一定优势。但目前的破骨细胞培养较复杂,且主要是骨来源的原始细胞,如何建立简便迅速的人骨髓破骨细胞培养测定体系是我们进一步的研究方向。

  吸收陷窝数与吸收陷窝面积随培养天数的不同变化表明:(1)在本实验条件下,观察到的不仅是成熟的OC的活性,而且包括在培养过程中不断分化成熟OC的功能。(2)破骨细胞及其前体细胞均有破骨能力。(3)较多的具有破骨细胞特性的细胞和相对较少的吸收陷窝形成,提示并非所有形成的破骨细胞均具有破骨能力,其功能状态的激活有赖于接种调节因素。(4)破骨细胞的骨吸收并不均匀,一方面是由于新分化成熟的破骨细胞数目的影响,另一方面可能是成骨细胞与破骨细胞间、破骨细胞与破骨细胞间的协同调节及培养环境中细胞因子刺激所产生的累积效应,这提示对于老年骨质疏松的药物治疗必须是连续的综合治疗,越早效果越好。(5)通过选择接种方式和调整培养条件可以研究OC的骨吸收活性及分化成熟过程。

  在许多常见病中,如骨质疏松症、原发性骨肿瘤等都可见到破骨细胞的活化 [4,5] 。体外破骨细胞性骨吸收的研究是骨性疾患研究的基本方法之一,因此,破骨细胞功能的定量测定将为这方面研究提供较好的实验手段。

  【参考文献】

  1 Pankka V,Lehenkan P,Sassi ML,et al.Estrogen reduces thedtyth of re-sotytion pits by disturbing the organic bone matrix degradation activity ofmature osteoclasts.Endocrinolo,2001,142(12):5371.

     2 Webster TJ,Ergun C,Doremus RH,et al.Enhanced osteoclast like cell functions on nanophase ceramics.Biomaterials,2001,22(11):1327.

  3 Gray C,Mane H,Arora M,al.Glutamate does not play a major role incontrolling bone growth.J Bone Miner Res,2001,16(4):742.

     4 Yuasa T,Miyamoto Y,Ishikawa K,et al.In vitro resoffition of three ap-atite cements with osteoclasts.J Biomed Mater Res,2001,54(3):344.

  5 Faucheux C,Nesbitt SA,Horton MA,et al.Cells in regeneratingdeer antler eartilage provide a microenvironment that supports osteoclast dif-ferentiation.J Exp Biolg,2001,204(Pt3):443.

  作者单位:130031吉林长春,首钢吉林柴油机厂医院外科(△ 内科)

  (编辑:罗 彬)

作者: 邹兴斌,于振波,丁洪月,赵树燕 2006-8-20
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