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【摘要】 细胞可经多种途径修复电离辐射所致的DNA损伤，但当机体启动跨损伤合成系统时，有些DNA损伤可逃避修复而在基因组上保留下来，跨损伤合成可使细胞耐受其DNA损伤，提高细胞对电离辐射杀细胞效应的抵抗性，改变细胞的辐射敏感性。这一过程需要线粒体及多种DNA聚合酶的参与。
【关键词】 跨损伤合成；Rev1；线粒体；核基因组突变
DNA是细胞生长、发育、繁殖和遗传的重要物质基础，它蕴藏着丰富的遗传信息，通过转录和翻译，指导蛋白质和酶的生物合成，主宰细胞的各种生理功能。细胞在各种内外环境因素的不断刺激下，通常会发生DNA损伤，电离辐射即是其中一种可致DNA损伤的重要因素，电离辐射所致的DNA损伤是细胞突变的重要原因，严重时可造成细胞癌变，导致肿瘤的发生。然而细胞可通过多种途径对各种类型的DNA损伤进行修复，包括DNA损伤修复系统的启动、细胞周期检查点（checkpoint）的控制、细胞凋亡（apoptosis）及损伤耐受。损伤导致DNA复制受阻时，人们通常会考虑到细胞周期检查点，认为细胞分裂周期会在检查点处停下来，以使损伤的DNA有足够的时间被修复，以便DNA复制和细胞分裂能继续进行，但事实并不完全如此，最近的研究表明，DNA损伤并不总是被除去，当损伤负荷（lesion burden）超过细胞修复机制所能承受的能力或损伤本身不能被其修复途径识别、修复时，一些DNA损伤会在基因组上暂时保留下来，而带有大量未修复损伤的细胞照样能进行DNA复制及分裂，这就是DNA的跨损伤合成（translesion synthesis, TLS），通常又被称为损伤旁路（damage bypass），原核细胞、酵母和人体细胞中都存在跨损伤合成的DNA聚合酶，正是这种跨损伤合成系统的存在使DNA复制受阻恢复，细胞周期继续，细胞耐受其DNA损伤，降低了细胞对各种DNA损伤因素包括电离辐射杀细胞效应的敏感性，其后果往往是使细胞更易于发生突变，甚至癌变。本文旨在通过探讨跨损伤合成机制及其与辐射敏感性的关系，进一步了解肿瘤及遗传性疾病的发生发展机制，为疾病预防和治疗提供科学依据［1，2］。
损伤忍受使细胞在DNA损伤的情况下完全复制基因组。与DNA修复不同，损伤忍受并不消除DNA损伤。复制过程中，直接复制损伤的DNA模板，是损伤忍受的重要机制。一般分成四个步骤：（1）损伤识别；（2）以损伤DNA为模板插入核苷；（3）在损伤的子链延伸DNA合成；（4）复制保存。损伤通过分为两种类型：无错旁路途径和易错旁路途径。前一种在对应损伤的部位插入正确的核苷，而后者通常在对应损伤的部位插入错误的核苷。因此，无错损伤旁路途径是一种避免突变的机制，而易错损伤旁路途径则是一种产生突变的机制。在细胞中，易错损伤旁路途径是DNA损伤诱导突变的主要机制。
近年来，人们在原核细胞和真核细胞中发现了多种特异的DNA聚合酶，大部分属于一个蛋白质超家族，聚合酶Y家族，他们没有3'→5'核酸外切酶活性，在复制未损伤的DNA时表现较低的可靠性和连续性。聚合酶Y家族通过跨损伤合成过程复制通过受损伤的DNA模板。其他几种特异聚合酶A，B，X家族具有相同的功能［3］。Rev1、Rev3、Rev7都属于这个家族。
1 Rev1在TLS（跨损伤合成）中的作用
芽生酵母S.cerevisae中，已知RAD6上位群（epistasis group）基因参与损伤DNA的复制后修复（postreplication repair, PRR）, RAX基因群介导的复制后修复其实质就是复制后的跨损伤合成，包括三个独立的旁路，两个是无误性的而另一个则是易误性的。现已发现RAD6上位群中的REV1、REV3、 和REV7等基因参与易误性跨损伤合成旁路，其中的Rev3和Rev7蛋白结合一起形成具跨损伤合成能力的DNA聚合酶ζ。DNA聚合酶ζ催化的跨损伤合成过程还需要有Revl蛋白参与。Revl蛋白氮基端序列与E. coli UmuC及DinB蛋白同源。Revl蛋白具有DNA模板指导的dCMP转移酶活性，能催化dCMP专一性插入到模板无碱基位置的对应部位上，Rev-3和Rev7蛋白组成的DNA聚合酶ζ是一易误性DNA聚合酶，其中Rev3为催化亚基，Rev-1蛋白与DNA聚合酶α，δ及ε，属同一家族，酵母REV3基因缺失并不致死，可见它并非是必需基因，其作用可能仅限于跨损伤合成;Rev7是该酶的一个辅助因子，起增强Rev3蛋白稳定性及其跨损伤合成效率的作用。DNA聚合酶（能跨越胸腺嘧啶二聚体及其他类型的DNA损伤。酵母中模板无碱基位置的跨损伤合成是通过DNA聚合酶及Revl转移酶两者协同作用完成的，Revl蛋白先在模板无碱基位置的对应部位上插人1个C残基而后DNA聚合酶才能进行有效延伸，体外试验发现Revl不影响DNA聚合酶跨越胸腺嘧啶二聚体的能力，缺乏Revl蛋白时，DNA聚合酶ζ照样能通过插入错误碱基有效跨越模板上的胸腺嘧啶二聚体［4～7］。酵母REV-3人同源基因hREV3也已被克隆，hREV3基因定位于染色体1p32-33,蛋白质序列对比表明该基因的编码产物是人DNA聚合酶ζ的催化亚基，与其酵母同源基因相类似，hREV3基因参与人体细胞内的易误性跨损伤合成旁路［8］。
在酵母中，Rev1在聚合酶ζ突变通路中发挥作用［7,9］。这个通路是易错损伤旁路的主要途径，在由紫外线、acetylaminofluorene引起突变和AP位点处是必须的。在人类细胞中，RAD6，RAD18，REV1，REV3，REV7已经被识别和克隆出来，REV1蛋白质同样具有dCMP转移酶活性，能将胞嘧啶插入与G，U和AP位点相对应的位置［10］。人们发现mPolκ特异性与鼠Rev1蛋白结合，并绘出了在这个特异性结合作用中mRev1的C-端结构域。重要的是mRev1与其他几个特异的DNA聚合酶，mPolι，mPolη和异聚合酶mPolζ的Rev7亚基发生相互作用。在这些作用中，mRev1的C－端有限结构域是必须的［11］。Rev1可能起着分子转移位点的作用，把跨损伤修复的各种聚合酶运送到阻止DNA复制的原始模板末端，可能Rev1蛋白与阻止复制的几种蛋白质相互发生作用。如何选择特定的跨损伤合成聚合酶通过特定的碱基损伤的机制仍然不是很清楚，可能不同的Rev1/聚合酶复合物对不同部位的碱基损伤有着不同的亲和力。总之，现有研究表明，Rev1蛋白质在选择跨损伤合成聚合酶过程中起着重要的作用［11］。
2 线粒体与跨损伤合成
在酵母中，（ⅰ）用抗霉素A作用与野生型酵母，用与阻断线粒体复合物Ⅲ的氧化磷酸化，（ⅱ）发生突变，线粒体DNA不完整的酵母（rhoˉ）和（ⅲ）缺失线粒体DNA的酵母（rho0）,三组经过处理的酵母其基因突变频率比未经处理的或野生型酵母高2～4倍。抗霉素A阻断氧化磷酸化使细胞内活性氧水平增加。而与之相反，线粒体功能缺失能降低细胞内的活性氧水平。而核基因组突变却比对照组高2～3倍。已经证明在rho0细胞，REV1、REV3、REV7基因产物都参加了DNA差错倾向合成，导致核基因组突变形成。然而DNA差错倾向合成并没有参与由抗霉素A使线粒体功能障碍引起的核基因组突变［12］。总之，实验数据表明，线粒体功能障碍是诱导核基因突变的物质，多种途径可以导致核基因突变表型。有报告建议线粒体功能障碍有影响细胞核突变的可能性［13］。实验表明，线粒体功能在保持维持核基因组稳定性方面发挥着重要作用。人们对线粒体和细胞核的联系进行了广泛的研究［14,15］。实验表明，线粒体功能障碍，细胞核Rtg1和Rtg3表达上调，Rtg2也参与了线粒体和细胞核的联系。在线粒体功能障碍时，某些基因可能发挥了保持核基因稳定的作用。但是确定这些蛋白质在线粒体介导细胞核基因突变中的作用，还需要进一步的研究［15］。在酵母和哺乳动物细胞，大部分核DNA突变与TLS途径有关，因此Anne Karin等对TLS是否参与了线粒体功能障碍引起的核DNA突变进行了研究［12］。对rho0携带正常Rev1、Rev3、Rev7基因的细胞系的核基因突变进行观察，发现在野生型细胞，使Rev基因失活能降低自发突变率［12］。同时发现rho0和rho-和野生型相比在突变类型上没有大的差异，但A：T—T：A颠换和移码突变只发生在rho0和rho-细胞系。这些结果表明在rho0和rho-细胞系增加的损害与发生在野生型细胞系的损害不同，灭活TLS途径能抑制rho0细胞系的自发突变，表明在rho0细胞，线粒体介导的基因突变依赖于Rev1、Rev3、Rev7蛋白的作用［12］。而阻断线粒体的氧化磷酸化，易错跨损伤修复并没有参与基因突变。实验证明，线粒体功能在维持核基因稳定性上发挥着重要作用。线粒体DNA缺失导致核基因突变增加，Rev1,Rev3,Rev7都参加了跨损伤合成。线粒体是细胞程序化死亡的首要调节者［16］。由于分子生物学技术的发展，人们认识到几个核内基因对放射敏感性的影响［17］。线粒体是细胞内唯一携带遗传物质的细胞器，它编码一些蛋白质，同时为细胞生命活动提供能量。最近的一些实验表明，细胞核外DNA，即线粒体DNA与老化、神经肌肉疾病、糖尿病和癌变有着密切的关系［18～20］。研究表明膀胱癌、头颈部肿瘤、肺癌患者的mtDNA变异与丢失频率比p53高19-220倍［21］。
3 跨损伤合成与辐射敏感性的关系
一个缺乏mtDNA（线粒体DNA）的人类细胞株显示了能够抵抗高浓度氧损伤引起的细胞死亡的作用［22］。唐劲天、李利亚研究了人类成纤维细胞中，具有正常mtDNA细胞（rho+）、缺乏mtDNA细胞（rho0）和mtDNA变异的细胞（rho-）受到照射后，其细胞周期变化和对凋亡的影响状况，从而了解mtDNA在电离辐射中的作用［23］。室温下伽马射线照射，剂量率1.27Gy/min,照射剂量分别为0、1、2、3、4、6、8Gy,细胞培养记录形成的集落数，并用流式细胞仪分析细胞周期变化和凋亡的比例，发现在2Gy照射后，ρ+和ρ0细胞株，可见G1期阻滞，在syn- 细胞株细胞周期分析中可见中等程度的G2阻滞。5Gy照射后，三种细胞株均可见明显的G2阻滞，且细胞凋亡数量也不断增加［24～27］。而肿瘤细胞普遍而复杂的一个特性是他们的线粒体功能的缺失。电子显微镜研究发现在肿瘤细胞，线粒体减少且结构发生了改变［28，29］。在一系列肿瘤细胞，包括卵巢、甲状腺、腮腺、肾、肝脏、肺、结肠、胃、脑、膀胱和头颈部肿瘤以及白血病和胸部肿瘤中普遍发现线粒体DNA发生了突变［30～33］。而在实验中，线粒体DNA缺失或异常的细胞表现了较高的放射抗性。细胞mtDNA缺乏影响辐射敏感性，但不能完全解释为什么它会产生对照射损害的抵抗作用。一种假设认为细胞坏死和凋亡过程中需要从正常的线粒体获得更多的能量［34］，当能量的供应发生问题时，可能引起对照射的抵抗。另一种假设是mtDNA含有诱导和抑制细胞凋亡的基因，mtDNA的缺失导致凋亡的减弱和对电离辐射的抗拒。而线粒体缺失的细胞核基因不稳定，与Rev1,Rev3,Rev7参与跨损伤合成有关。放射线对细胞DNA的损伤，可能通过跨损伤合成使细胞复制能够进行下去，使凋亡减少，阻断跨损伤合成途径，使DNA复制不能完成，促进细胞凋亡，可提高肿瘤细胞对放射线的敏感性。
【参考文献】
1 Wood R D. Varians on a theme. Nature， 1999， 399 （6737）:639-640.
2 Baynton K，Brosson Roy A，Fuchs R P P. Analyse of damage tolerance pathways in Saccharomyces cerevisae: a requirement for Rev3 DNA polymerase in translesion synthesis.Mol Cell Biol,1998， 18 （2）: 960-966.
3 Caixia Guo, Paula L.Fischhaber,Margaret J.Luk-Paszyc1, Yuji Masuda2,Jing Zhou, Kenji Kamiya2, Caroline Kisker3 and Errol C.Friedberg4 Mouse Rev1 protein interacts with multiple DNApolymerases involved in translesion DNA synthesis. The EMBO J， 2003 ，15;22（24）:6621-6630.
4 Baynton K，Brosson Roy A，Fuchs R P P. Analyse of damage tolerance pathways in Saccharomyces cerevisae: a requirement for Rev3 DNA polymerase in translesion synthesis.Mol Cell Biol,1998， 18 （2）: 960-966.
5 Lindahl T，Wood R D.Quality control by DNA repair.Science, 1999， 286 （5446）: 1897-1905.
6 Nelson J R， Lawrence C W，Hinkle D C. Thymine-thymine dimer bypass by yeast DNA polymerase zeta. Science, 1996， 272（5268）: 1646-1648.
7 Nelson J R，Lawrence C W,Hinkle D C. Deoxycytidyl transferase activity of yeast REV1 protein. Nature, 1996, 38 （6593）: 729-731.
8 陈建明，余应年.跨损伤合成的DNA聚合酶—一类新的DNA聚合酶.Prog.Biochem.Biophys，2001， 28 （1）：70.
9 Larimer F W,Perry,J R.and Hardigree AA.（1998） The REV1 gene of saccharomyces cerevisiae:isolation,sequence and functional analysis. J Bacteriol，1989，171（1）:230-237.
10 Lin W,Xin H，Zhang,et al.The human REV1 gene codes for a DNAtemplate-dependent dCMP transferase.Nucleic Acids Res,1999,27:4468-4475.
11 Caixia Guo, Paula L.Fischhaber,Margaret J.Luk-Paszyc1, Yuji Masuda2,Jing Zhou, Kenji Kamiya2, Caroline Kisker3and Errol C.Friedberg4. Mouse Rev1 protein interacts with multiple DNA polymerases involved in translesion DNA synthesis. EMBO J， 2003，22（24）:6621-6630.
12 Anne Karin Rasmussen, Aditi Chatterjee, Lene Juel Rasmussen,et al. Singh1. Mitochondria-mediated nuclear mutator phenotype in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res， 2003，31（14）:3909-3917.
13 Hruban Z, Mochizuki Y, Morris HP,et al.Ultrastructure of Morris renal tumors. J Natl Cancer Inst， 1973，50（6）:1487-1495.
14 Liu,Z. and Butow R A.A transcriptional switch in the expression of yeast tricarboxylic acid cycle genes in response to a reduction or loss of respiratory function. Mol. Cell. Biol, 1999，19： 6720-6728.
15 Sekito T, Thornton J，Butow,R.A.Mitochondria-to-nuclearsignaling is regulated by the subcellular localization of the transcription factors Rtg1p and Rtg3p. Mol Biol Cell，2000，11（6）:2103-2105.
16 Petit,P.X. and Kroemer,G.Mitochondrial regulation of apoptosis. In Singh,K.K. （ed.）, Mitochondrial DNA Mutations in Aging, Disease and Cancer. Springer, New York, NY.1998.
17 Hall EJ . Molecular techniques in radiobiology. In : Radiobilogy for the radiologists , Philadelphia : Lippincott Press , 1994， 385-417.
18 Johns DR. Mitochondrial and disease. N Engl J Med , 1995, 333 : 638-644.
19 Johns DR. The other human genome : mitochondrial DNA and disease. Nat Med，1996，2（10）:1065-1068.
20 Birch Machin MA. Mitochondrial and skin disease. Clin Exp Dermatol , 2000 , 25 : 141-146.
21 Fliss MS , Usadel H , Caballero OL , et al . Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids. Science , 2000 , 287（5460） : 2017-2019.
22 Yoneda M, Katsumata K, Hayakawa M, et al . Oxygen stress induces an apoptotic cell death associated with fragmentation of mitochondrial genome. Biochem Biophys Res Commun，1995，209（2）:723-729.
23 唐劲天，李利亚.线粒体DNA影响细胞的放射敏感性.Chin J Radiat Oncol,2001,10（1）：35.
24 Soldatenkov VA , Prasad S , Notario V , et al . Radiation induced apoptosis of Ewing’s sarcoma : DNAfragmentation and proteolysis of poly （ADP2ribose） polymerase. Cancer Res , 1995 , 55 : 42402-4242.
25 Darzynkiewicz Z , Bruno S , del Bino G, et al . Features of apoptosis cells measured by flow cytometry. Cytometry , 1992 , 13（8） : 795-808.
26 Gong J , Traganos F , Darzynkiewicz Z , et al . A selective procedure for DNA extraction from apoptosis cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry. Analytical Biochemistry , 1994 , 218（2） : 314-319.
27 Telford WG, King LE , Fraker PJ . Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry. J Immunol Methods , 1994 , 172（1） : 1-16.
28 Hruban Z, Mochizuki Y, Morris,HP,et al.Ultrastructure of Morris renal tumors. J Natl Cancer Inst,1973, 50, 1487-1495.
29 White M T, Arya D V.Tewari KK.Biochemical properties of neoplastic cell mitochondria. J Natl Cancer Inst,1974，53（2）:553-559.
30 Singh KK.Mitochondrial DNA Mutations in Aging, Disease and Cancer. Springer, New York, NY，1998.
31 Wallace D C.Mitochondrial diseases in man and mouse. Science，1999，283（5407）:1482-1488.
32 Penta J S, Johnson FM, Wachsman JT,et al.Mitochondrial DNA in human malignancy. Mutat. Res,2001，488（2）:119-133.
33 Copeland WC, Wachsman JT, Johnson FM,et al.Mitochondrial DNA alterations in cancer. Cancer Invest,2002，20（4）:557-569.
34 Li P , Nijhawa D , Budihardjo I , et al . Cytochrone C and dATP dependent formation of Apaf2/ caspase9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell ,1997,91:479-484.
作者单位： 100088 北京，中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所
（编辑：齐永）