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【摘要】 目的 建立含抑菌成分中成药固体制剂微生物限度检查验证方法。方法 采用常规方法验证细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，采用离心沉淀法加培养基稀释法合用检查验证细菌计数，采用直接法验证活螨。结果 采用常规方法，霉菌及酵母菌计数的回收率均＞90%，细菌计数的回收率＜70%，采用离心沉淀法加培养基稀释法合用检查细菌计数＞90%。结论 在建立药品微生物限度检查验证方法时，有时需采用非常规的方法进行试验，才能得到比较满意的结果。
【关键词】 验证；中成药；微生物
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、敷料受微生物污染程度的方法。当建立药品微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数、控制菌检查、活螨检查方法的验证，以确认所采用的方法是否适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌、控制菌、活螨数的测定。
1 仪器与材料
1.1 仪器 无菌室、生化培养箱。
1.2 材料 石黄抗菌片(河南禹州市药王制药有限公司生产，批号：041107、041201、050202)。标准菌种：枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、白色念球菌［CMCC(F)98001］、黑曲霉菌［CMCC(F)98003］。
2 验证方法
2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数的验证
2.1.1 菌液制备 取经37℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌肉汤培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含菌50～100cfu的菌悬液备用。取经25℃培养18～24h的白色念球菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml含菌50～100cfu的菌悬液备用。取经25℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3～5ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1ml菌液加9ml 0.9%无菌氯化钠溶液，逐管10倍稀释为每1ml含菌50～100cfu的菌悬液备用。
2.1.2 供试液的制备 称取样品10g，加无菌0.1%蛋白胨-氯化钠稀释液100ml使浓度成1∶10供试液。霉菌及酵母菌检查：取1∶10供试液按常规方法检查。细菌数检查：方法一，取1∶10供试液按常规方法检查；方法二，取40ml的供试液，先以500r/min离心5min，取全部上清液，再3000r/min离心20min，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量，作为试验用液，然后采用培养基稀释法，每皿加0.2ml试验用液。
2.1.3 回收率测定 试验组：分别取供试液0.2ml和含菌50～100cfu的菌悬液1ml同时加入平皿中，立即倒入琼脂培养基，待凝固后，置规定温度(细菌培养温度为35℃，培养48h；霉菌及酵母菌培养温度为25℃，培养72h)培养。菌液组：分别于平皿中加入含菌50～100cfu的菌悬液1ml，倒入培养基，待凝固后置规定温度(同试验组)培养。供试液对照组：加供试液1ml于平皿中，倒入培养基，待凝固后，置规定温度(同试验组)培养。稀释剂对照组：加入无菌0.1%蛋白胨-氯化钠稀释液1ml于平皿中，倒入培养基，待凝固后，置规定温度(同试验组)培养。结果见表1。
表1 回收率试验结果 （略）
2.1.4 结果 按《中国药曲》2005年版一部附录XⅢC微生物限度检查法中细菌数、霉菌及酵母菌数计数验证方法验证，结果表明可用常规方法检查霉菌及酵母菌数［1］。用常规方法进行本品的细菌数计数检查时，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率不能达到70%，故不能用常规方法进行本品的细菌数计数检查。用离心沉淀法加培养基稀释法合用检查本品的细菌数。
2.2 控制菌检查验证
2.2.1 菌液制备 取经37℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每毫升含10～100cfu菌。
2.2.2 试验方法 样品组：称取样品10g，加无菌0.1%蛋白胨-氯化钠稀释液100ml使浓度成1∶10供试液。取供试验10ml加入于100ml BL增菌液中，35℃培养24h，取上述增菌液0.2ml加入至5ml MUG，35℃培养24h。结果观察及判定：(1)分别于5h和24h 365nm紫外光下观察是否呈现荧光，呈现荧光为阳性，未呈现荧光为阴性。(2)观察后，加入数滴靛基质试剂，观察液面是否呈玫瑰红色，出现玫瑰红色为阳性，未出现玫瑰红色为阴性。试验组：称取样品10g，加无菌0.1%蛋白胨-氯化钠稀释液100ml使浓度成1∶10供试液。取供试液10ml加1ml 10～100cfu大肠埃希菌同时加入于100ml BL增菌液中，35℃培养24h，取上述增菌液0.2ml加入至5ml MUG，35℃培养24h。结果观察及判定同样品组。阴性菌对照组：称取样品10g，加无菌0.1%蛋白胨-氯化钠稀释液100ml使浓度成1∶10供试液。取供试液10ml加1ml 10～100cfu金黄色葡萄球菌同时加入于100ml BL增菌液中，35℃培养24h，取上述增菌液0.2ml加入至5ml MUG，35℃培养24h。结果观察及判定同样品组。阳性对照组：将10～100cfu大肠埃希菌加入于100ml BL增菌液中，35℃培养24h，取上述增菌液0.2ml加入至5ml MUG，35℃培养24h。结果观察及判定同样品组。阴性对照组：取稀稀液10ml加入于100ml BL增菌液中，35℃培养24h，取上述增菌液0.2ml加入至5ml MUG，35℃培养24h。结果观察及判定同样品组。结果见表2。
表2 控制菌检查试验结果 （略）
2.2.3 结果 按《中国药典》2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法中控制菌检查验证方法验证，结果表明可用常规方法检查大肠埃希菌［1］。
2.3 活螨检查验证 取样品，用直检法检查活螨。
3 小结
在验证含抑菌成分中成药固体制剂微生物限度检查方法是否有效时，对于不同的品种，验证方法有可能不完全相同。比如有的含抑菌成分的产品可能用常规的方法对所有的菌都可进行验证。当产品含原生药时，则还需进行大肠菌群检查的验证。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中国药典2005年版，一部.北京：化学工业出版社，附录93.
作者单位：1 400015 重庆，重庆医疗器械质量检验中心
2 重庆，重庆市药品检验所
(编辑：汪 洋)