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【摘要】 目的 建立用内标法测定人血浆中头孢羟氨苄浓度的HPLC-UV方法。方法 用10％高氯酸直接沉淀血浆蛋白，以对氨基苯甲酸为内标，测定血浆中头孢羟氨苄的浓度。结果 血浆中杂质不干扰样品峰和内标峰，20.0、2.0、0.2μg/ml的回收率分别为98.1%，98.7%， 91.1%；批内精密度均小于8.0%（高、中、低浓度分别为3.8%，5.6%，7.3%），批间精密度均小于10%（高、中、低浓度分别为 4.1%，6.5%，9.7%），最低检测限为0.1μg/ml，线性范围为0.2～30.00μg/ml；血浆中头孢羟氨苄冻融是稳定的；精密度也符合要求。结论 该方法稳定且精密度好，准确可靠，适用于头孢羟氨苄血浆浓度测定。
【关键词】 头孢羟氨苄；对氨基苯甲酸；高效液相色谱-紫外检测器
【Abstract】 Objective To establish the determination method of cefadroxil in healthy volunteers plasma. Methods Plasma protein was precipitated by perchloric acid (10%), and paraaminobenzoic acid was used as internal standard. Plasma concentrations of cefadroxil and internal standard were determined by HPLC-UV.Results The chromatographic peak of cefadroxil and internal standard was not interfered by foreign matter. Recovery rate of 20.0、2.0、0.2μg/ml was 98.1%, 98.7%, 91.1%, respectively. Precision in or between batch was less than 8.0% and 10%, respectively. Lowest detectable limit was 0.1μg/ml and linear range was 0.2～30.00μg/ml. The freeze thawing of plasma was stable.Conclusion The method was reliable and stable, it was suitable for determination the concentration of cefadroxil in plasma.
【Key words】 cefadroxil; paraaminobenzoic acid; HPLC-UV
头孢羟氨苄（CFO）为一半合成广谱杀菌性头孢类抗生素, 对β-内酰胺酶较稳定, 抗青霉素酶或头孢菌素酶的作用比其他的头孢菌素更强, 主要用于葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌引起的呼吸道、皮肤软组织、口腔、消化道等感染性疾病。文献报道的检测方法有直接沉淀法［1,2］，也有加入阿莫西林为内标［3］的直接沉淀法。本文采用HPLC-UV法，以对氨基苯甲酸为内标，测定头孢羟氨苄血药浓度。
1 实验材料
1.1 试验药品 头孢羟氨苄标准品: 中国药品生物制品检定所提供，含量98.54%,批号:920507。用超纯水配制成相当于2.0mg/ml 贮备液。临用时稀释至相应的浓度。对氨基苯甲酸(内标)江苏省药品检验所提供，用甲醇配制成相当于1.0mg/ml 贮备液。临用时稀释至 100μg/ml的浓度。
1.2 试剂 乙腈（色谱纯）, Fisher Company, Inc,USA; 其余试剂均为市售分析纯。
1.3 仪器 导津高效液相色谱仪（2010）；Milli-Q Gradient A10超纯水器（Millipore Inc, USA）。
2 血浆中阿莫西林的HPLC法测定
2.1 色谱条件 流动相由0.02mol/L KH2PO4(磷酸调pH=4.0)和乙腈（97：3 v/v）组成，流速1.0ml/min；色谱柱为Alltima C18 5.0μm 250mm×4.6mm I.D.；柱温箱温度 40℃；检测波长230nm。
2.2 血浆样品的提取与分离 取血浆0.5ml，精密加入10μl内标（100μg/ml对氨基苯甲酸），振荡15s,加入0.2ml高氯酸（10％），振荡 1min，15000rpm 离心10min。取上清液进样，用峰面积比进行定量分析。
2.3 方法的专属性 在本实验条件下，头孢羟氨苄和对氨基苯甲酸有较大的色谱峰和较好的分离度，血浆中杂质不干扰样品峰和内标峰，基线噪音小，头孢羟氨苄和对氨基苯甲酸的保留时间约为9.5min 和12.5min(图1)。
2.4 血浆中头孢羟氨苄标准工作曲线制备及其最低检测浓度测定 取空白血浆0.50ml，加不同量的标准品，使其浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0和30.0μg/ml，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，记录样品和内标峰面积，利用样品浓度C对样品与内标峰面积比R作直线回归，得回归方程R=0.0009+0.0518C，r=0.9996，(Ｐ<0.01, n=5)(见图2)，线性范围0.2～30.00μg/ml，最低检测浓度0.1μg/ml。
2.5 回收率测定 取空白血浆0.5ml,加入不同浓度标准品,使其浓度分别为0.2、5.0和30.0μg/ml, 按“血浆样品的提取与分离”项下操作, 记录样品与内标峰面积Rs，将样品峰面积/内标峰面积代入到标准曲线的回归方程，得到相应的浓度，从而求得血浆中头孢羟氨苄的回收率,高、中、低浓度的回收率分别为：98.1%，96.3%及91.1%。
图1 头孢羟氨苄色谱图
A.空白人血浆; B.标准品; C. 人空白血浆+标准品; 1. 头孢羟氨苄 2. 对氨基苯甲酸
图2 血浆中头孢羟氨苄工作曲线2.6 方法的精密度试验 取空白血浆0.5ml, 加入不同量的标准品, 使其浓度分别为0.2、5.0和30.00μg/ml，按“血浆样品的提取与分离”项下操作，记录样品与内标峰面积比值R，代入同一条工作曲线中算得浓度，以此作为精密度指标。测得批内变异和连续3天内的批间变异，高、中、低浓度的批内精密度分别为：3.8%，5.6%及7.3%；高、中、低浓度的批间精密度分别为：4.1%，6.5%及9.7%。
2.7 稳定性试验 按标准曲线测定方法配置0.2，5.0，30.0μg/ml的3种不同浓度的血浆样本各2ml。各浓度取200μl按血浆样品处理方法处理后立即测定，另取200μl常温放置8h后按血浆样品处理方法处理后测定，剩余血浆冷冻贮藏，并分别于第3、6、10天取出血浆解冻，各取200μl按血浆样品处理方法处理后测定，计算平均值和精密度，高、中、低浓度的血样稳定性精密度分别为：3.5%，5.5%及8.7%。表明稳定性良好。将第0天处理好的稳定性样品放置于冰箱冷藏室，分别于第2、4、6、8h测定该份样品，考察其样品放置的稳定性。高、中、低浓度的样品放置稳定性精密度分别为：3.2%，5.9%及7.8%。样品在8h内稳定。
2.8 准确度试验 按标准曲线测定方法配制0.2，5.0，30.0μg/ml的三种不同浓度的血浆样本，重复测定5次，计算其平均值和精密度，高、中、低浓度的准确度的变异系数分别为：1.3%，3.1%及4.2%。表明准确度较好。
3 讨论
本研究建立的HPLC -UV法采用对氨基苯甲酸作内标，测定头孢羟氨苄血浆浓度，样品仅以不到1/2的高氯酸直接沉淀蛋白，采用低温高速离心后即可取上清液直接进样分析，操作简便、快速。色谱峰形对称且无肩峰，采用峰面积比对浓度回归，相关性较好。自动进样器的应用减少了认为误差，明显提高了效率和精确度。
本方法简便，稳定性好，特异性高，信/噪比>3，无杂质干扰。方法稳定且精密度良好(误差<10 %)，准确可靠，适用于头孢羟氨苄血浆浓度测定。
【参考文献】
1 范国荣，李珍，唐世新，等. 头孢羟氨苄分散片的人体药代动力学及相对生物利用度研究. 第二军医大学学报，2002，23(4)：394-396.
2 姬海红，唐新娟，柳晓泉，等. 头孢羟氨苄分散片相对生物利用度研究. 西安医科大学学报，2000，21(5)：420-421.
3 孟玲，张静，邵志高. 两种头孢羟氨苄胶囊的药代动力学与生物等效性研究. 中国药房，2002，13(12)：735-737.
作者单位：210029 江苏南京，南京医科大学第一附属医院(Δ药理学博士，通讯作者)
(编辑：黄 杰)