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【摘要】 目的 建立小鼠冠状病毒感染小鼠模型，并使此模型成为研究抗SARS药物的替代模型。方法 将30μl小鼠冠状病毒原液用移液枪滴入接毒组小鼠鼻腔，对接毒小鼠进行观察、测量、取样和检测等，并与SARS各指标比较。结果 小鼠冠状病毒感染后第2天就出现弓背、竖毛、蜷缩、颤抖、打堆等临床症状；体温出现先升后降，体重明显减轻；死亡率为100%；出现肺和肝脏严重坏死和出血灶，肝细胞呈弥漫性肿胀，肠道内出血等病理变化；在肝、肾、肺、脾、肠和大脑都能检出病毒；感染期内未能检出小鼠冠状病毒抗体；能产生高水平的IL-10、IFN-γ、TNF-α和低水平的IL-2，IL-4无明显变化。结论 小鼠冠状病毒和SARS病毒在临床病理学改变方面表现为一种全身多器官损伤性疾病，在发病的免疫学机制方面免疫器官是病毒攻击的主要靶器官。
【关键词】 小鼠冠状病毒；替代模型；SARS
Study of the mice model infected with murine coronavirus for substitution of SARS
LIU Zhong-hua, LIU Xiang-mei, MIN Fan-gui, et al.Guangdong Experimental Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510260,China
【Abstract】 Objective To create the mice model infected with murine coronavirus for substitution of SARS. Methods Mice were infected with murine coronavirus through the nasal cavity, then observed and detected the changes. Results The infected mice showed severe clinical signs including low temperature, weight loss,100% mortality,the sereve pathologic changes including lung and liver tissues,IL-10、IFN-γ、TNF-α increased, IL-2 declined.Conclusion The clinicopathologic changes as general multiorgan lesions,the immunoesis is the immuo-organs as a attack target organs.
【Key words】 murine coronavirus; substitution model;SARS
自从非典型性肺炎病原体被诊断为新型冠状病毒以来，各种动物和人类的冠状病毒病受到高度关注。科研工作者也开始了对动物和人类冠状病毒的致病机制等更深入的研究和探索。并初步建立了SARS病毒灵长类模型，但一方面，SARS病毒是烈性传染病，每一次实验的费用非常高，而且还可能对实验人员和外环境造成很大危害，新加坡的实验室内研究人员和中国CDC实验人员感染SARS病毒的事例告诉我们研究SARS的高危害程度，国家为此对实验室作了明确的限定，许多科学家被迫停止SARS病毒的研究工作；另一方面，用于模型研究的实验动物中，猴是最昂贵的，而SARS病毒对小鼠等其他动物的敏感性不高，也就是SARS病毒有一定范围的宿主特异性。故寻找SARS病毒的替代模型非常紧迫和十分必要。
小鼠冠状病毒（又称小鼠肝炎病毒，缩写为MHV）与SARS病毒同属冠状病毒科冠状病毒属，二者之间有着许多共同的特性，都对感染动物的多个器官有较广泛的嗜性［1，2］。由于小鼠冠状病毒不传染给人类，利用小鼠冠状病毒感染其自然宿主小鼠，建立小鼠冠状病毒感染小鼠模型，以此模型作为SARS病毒的替代模型，不仅可以解决研究SARS病毒的安全性问题，也解决了SARS病毒对小鼠等动物敏感性不好的问题，而且，小鼠与猴相比，需要的实验成本非常低，影响因素较少，实验操作也要简便。因此，选用小鼠冠状病毒感染小鼠作为SARS的替代模型，能达到经济、实用、安全的目标。本文主要报道用小鼠冠状病毒感染小鼠，建立感染动物模型，确定病毒的感染途径、剂量、观察临床症状、各器官和免疫细胞的病理变化和死亡、病毒分离、测定血清抗体等模型指标。观察各指标同SARS的关系，为SARS药物及疫苗研究和检验提供安全的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选用18～22g的SPF级BALB/C小鼠130只［许可证号SCXK(粤)2003-0002］，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供。经5%随机抽样检测排除了小鼠冠状病毒自然感染。
1.1.2 饲料 选用高温高压灭菌饲料，由广东省医学实验动物中心提供。
1.1.3 毒株 小鼠冠状病毒(MHV)，从中国药品生物制品检定所购买。
1.1.4 麻醉剂 盐酸氯胺酮注射液 (规格0.1g/2ml) 上海中西药业股份有限公司新冈制药厂。
1.1.5 实验场所 本实验在广东省实验动物监测所的负压实验室中进行。
1.1.6 试剂 小鼠IL-10、IL-2、IL-4、IL-18、IFN-γ、TNF-α试剂盒(R&D公司)。
1.2 方法
1.2.1 病毒增殖 将小鼠冠状病毒接种在L929传代细胞上增殖，测得此病毒的TCID50为10-5.875。
1.2.2 动物分组 随机将BALB/c小鼠分为3组，每组雌雄各半。其中：(1)接毒组100只，其中接毒取材50只，接毒观察死亡率50只；(2)生理盐水对照组20只。为避免交叉感染，两组隔离饲养。
1.2.3 麻醉 将盐酸氯胺酮注射液配制成为20mg/ml的浓度，以0.1ml进行肌内注射。
1.2.4 接毒 将30μl冠状病毒原液滴入接毒组小鼠鼻腔；生理盐水对照组小鼠滴入30μl生理盐水。
1.2.5 饲养 接毒后正常饲养，供给饲料量为标准日粮，食用高压灭菌水，足量供给；熟料经高温高压消毒后使用。雌雄分笼饲养。
1.2.6 观察 接毒当天记为0天，接毒后24h记为第1天，接毒后48h记为2天，以此类推。观察小鼠的临床表现，包括其活动状态、反应性、饮食状况、呼吸状况及有无弓背、竖毛、蜷缩、颤抖和死亡等。
1.2.7 测量 接毒前用电子秤和测温仪分别测量体重与体温（记为第0天）；接毒后每隔24h再分别测量其体重与体温。体重精确到0.1g；体温精确到0.1℃。
1.2.8 取样 接毒后每隔24h取样1次，对照组随机1～2只，接毒取材组随机4～5只。所取样品均置于低温冰箱中保存。
1.2.9 病理观察 采用福尔马林固定，石蜡包埋、切片，H-E染色。
1.2.10 检测 所取器官充分剪碎后，加入无菌水，4℃4000RPM离心5min，取上清液进行PCR检测，以测其有无病毒。所取血清做ELISA检测，测其有无抗体产生。按细胞因子试剂盒说明书检测细胞因子。
2 结果
2.1 临床表现和死亡情况
2.1.1 症状和体征 在接毒后第2天开始出现弓背、竖毛、蜷缩、颤抖、打堆、采食量明显下降，第3天症状加剧，出现翻转现象。
2.1.2 体重与体温 接毒小鼠体温出现先升后降，在死亡前降至很低（无法用体温计测量）。接毒小鼠体重减轻。
2.1.3 死亡情况 在接毒后第3天开始出现死亡，死亡15只，第4天和第5天共死亡25只，第6天剩余的全部死亡。死亡率为100%。
2.2 病理变化
2.2.1 解剖病理 心脏出现白斑，肺和肝脏严重坏死，肝脏布满出血点和出血灶，大脑出血，肠道内有出血点，脾脏肿大。
2.2.2 组织病理学观察 汇管区周围的肝细胞呈弥漫性肿胀、水泡变性和坏死，细胞核固缩、碎裂、溶解消失，坏死区周围血窦充血(图1)。肺部充血、出血和坏死。脾白髓淋巴细胞明显减少，并伴有细胞坏死，核固缩和碎裂，红髓血窦扩张充血(图2)。肠道内出血，绒毛上皮细胞坏死脱落，固有层有炎症细胞浸润(图3)。
2.3 病毒分离和抗体测定
2.3.1 病毒分离 从接毒后第2天开始，用PCR方法在肝、肾、肺、脾、肠和大脑都能检出病毒，其中肝脏检出率最高。
2.3.2 抗体测定 在接毒后的第1～5天都不能检出MHV抗体。在后续实验中，用减毒MHV感染小鼠，在第9天能检出抗体，15天时抗体水平OD值达0.9以上。
2.4 细胞因子 对第1～5天的MHV接毒组小鼠血清进行细胞因子检测，结果为产生高水平的IL-10、IFN-γ、TNF-α和低水平的IL-2，IL-4无明显变化。
2.5 模型指标确定 小鼠冠状病毒感染小鼠的主要模型指标为：感染后小鼠第2天就出现弓背、竖毛、蜷缩、颤抖、打堆等临床症状；体温出现先升后降，体重明显减轻；死亡率为100%；出现肺和肝脏严重坏死和出血灶，肝细胞呈弥漫性肿胀，肠道内出血等病理变化；在肝、肾、肺、脾、肠和大脑都能检出病毒；感染期内未能检出MHV抗体；能产生高水平的IL-10、IFN-γ、TNF-α和低水平的IL-2，IL-4无明显变化。另外，在后续实验中发现，通过鼻腔、静脉和脑内等途径都能感染小鼠并发病死亡，不同品系小鼠敏感性不同，BALB/C小鼠最敏感。
3 讨论
根据分子病原学和冠状病毒基因系统进化，经全基因组序列分析显示小鼠冠状病毒和SARS病毒RNA有60%的同源性［3］，系统进化树分析显示SARS病毒与已知的II类病毒（小鼠冠状病毒和牛冠状病毒）距离最近。从基因结构上，小鼠冠状病毒和其他动物冠状病毒及SARS-COV在分子结构上有相似之处，主要由核衣壳蛋白（N蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和突起蛋白（S蛋白）组成。
小鼠冠状病毒感染是实验小鼠最为重要的病毒病之一。小鼠是该病的自然感染宿主。小鼠冠状病毒和SARS病毒在传染途径上有相似之处，SARS病毒主要通过接触呼吸道分泌物传播，也可通过被污染的手、玩具等经口鼻传播；小鼠冠状病毒病主要也经空气和接触传播，病鼠的粪便、鼻咽渗出物，甚至尿液中均含有大量的病毒，健康小鼠接触污染的饲料、饮水、用具和周围环境等，经口、鼻等途径发生感染。
在临床病理学改变方面小鼠冠状病毒和SARS病毒有重要类同，多项研究表明SARS是一种全身多器官损伤性疾病，具有较广泛的侵袭性和强烈的嗜血管性，血管内皮细胞变性及连接结构破坏导致血管通透性增加，造成肺、脾、肝、心、脑等脏器间质水肿［4,5］，SARS发病急，死亡率高。小鼠冠状病毒也可侵害多个器官和组织，出现肺和肝脏严重坏死和出血灶、肝细胞呈弥漫性肿胀、肠道内出血等病理变化；在主要脏器的血管周围可见淋巴细胞浸润及血管内皮细胞出现核浓缩、破碎、细胞质红染等病变，小鼠冠状病毒对小鼠也有很强致病性，发病急，死亡率100%。
在发病的免疫学机制方面，小鼠冠状病毒和SARS病毒也很接近，在SARS病毒，免疫器官是病毒攻击的主要靶器官，脾和淋巴结出现淋巴组织坏死，在病变的肺、淋巴结、脾脏等器官和组织内均有大量的单核巨噬细胞浸润，细胞因子中IL-6明显升高，IL-8和TGF-β明显降低，SARS患者早期的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞均明显降低，用SARS感染恒河猴后在第11～15天产生抗体［6］；在小鼠冠状病毒感染后，脾脏白髓淋巴组织增生，淋巴组织发生广泛坏死，病毒对淋巴细胞、网状内皮细胞、上皮细胞和实质细胞呈现杀细胞作用［7］。小鼠冠状病毒可改变免疫系统的应答参数，可影响巨噬细胞的数目、吞噬活性和杀伤肿瘤细胞活性，还可改变酶系统［8～10］，另外，CD4+、CD8+T淋巴细胞在MHV清除中发挥重要作用［11］，也能产生高水平的IL-10、IFN-γ、TNF-α和低水平的IL-2，IL-4无明显变化。
综合以上内容，说明以小鼠冠状病毒感染小鼠，以此模型作为SARS病毒的替代模型是完全可行的，同时，用此模型作为筛选抗SARS、流感等其他RNA病毒药物、疫苗和临床治疗的替代模型，具有一定的理论和现实意义［12］。
(本文图片见封三)
【参考文献】
1 Navas SS, Swl H, Chua MM, et al. Murine coronavirus spike protein determines the ability of the virus to replicate in the liver and cause hepatitis.J Virol, 2001,75:2452-2457.
2 Sonia NM,Susan RW. Review SARS:lessons learned from other coronavirus. Virol Immunology, 2003，461-474.
3 动物冠状病毒的抗原性、病原性、生态学和公共卫生意义的研究进展.www.ylxm.com 2003-10-25 榆林畜牧网.
4 秦川,佘铭鹏,朱华，等. SARS-CoV恒河猴模型动物中组织病理学动态变化.中国实验动物学会第六届学术年会论文集. 中国实验动物学会，2004，4:38-45.
5 广东省防治非典型肺炎科技攻关专题组.浅谈急性传染性非典型肺炎病理学及发病机制.广东医学, 2003(24): 18-20.
6 魏强,王健伟,张扬清，等. SARS冠状病毒感染恒河猴的病毒、血清学检测.中国实验动物学会第六届学术年会论文集.中国实验动物学会,2004,4: 46-48.
7 田克恭. 实验动物病毒性疾病. 北京:农业出版社,1991，76-83.
8 Pearce BD,Hobbs MV, McGraw TS, et al. Cytokine induction during T-cell-mediated clearance of mouse hepatitis virus from neurons in vivo. J Virol, 1994,68:5483-5495.
9 Perlman S. Pathogenesis of coronavirus-induced infection.Review of pathological and immunological aspects.Adv Exp Med Biol,1998,440:503-513.
10 Pillips JJ, Chua MM, Rall GF,et al. Murine coronavirus spike glycoprotein mediates degree of viral spread,inflammation,and virus-induced immunopathology in the central nervous system.Virology,2002,301:109-120.
11 高骏,王英,孙凤萍，等. 小鼠肝炎病毒研究进展.上海农业学报,2004，(20-2): 114-116.
12 付红焱,徐波,宫泽辉.小鼠肝炎病毒的研究近况.生理学进展, 2004，(35-4):367-370.
基金项目：广东省自然科学基金项目(编号：04001217)
作者单位： 510260 广东广州，广东省实验动物监测所
(编辑：汪 洋)