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用重组人胰岛素原类似物免疫制备抗胰岛素单克隆抗体 (pdf)
【摘要】 目的 制备抗胰岛素单克隆抗体（mAb）。方法 用重组人胰岛素原类似物免疫BALB/c小鼠制备免疫脾细胞，运用淋巴细胞杂交瘤技术将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。结果 建立了7株分泌抗胰岛素mAb的杂交瘤细胞系，命名为A、B、C、D、E、F和G；7株mAb的Ig亚类分别为IgM、IgM、IgM、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1；在夹心ELISA试验中，7株mAb均能与人、牛和猪胰岛素发生特异性免疫反应；在免疫印迹试验中，7株mAb均能与重组人胰岛素原类似物结合呈现一条蛋白印迹带。结论 7株mAb对人、牛和猪胰岛素均具有免疫反应性，可用于人和动物胰岛素的测定和纯化。
【关键词】 单克隆抗体（mAb）；胰岛素；重组人胰岛素原类似物
Development of monoclonal antibodies against insulin by immunization with recombinant human proinsulin analog
LIU Yu, WANG Yong-shan, SUN Mao-hua, et al.
Center for Disease Control and Prevention of Nanjing Command, Military Medical Institute of Nanjing Command, Nanjing 210002, China
【Abstract】 Objective To prepare monoclonal antibody (mAb) against insulinMethods Spleen cells from BALB/c mice immunized with recombinant human proinsulin analog were fused with SP2/0 myeloma cells by using hybridoma techniques.Results Seven hybridomas secreting mAb against insulin were established and designated A, B, C, D, E, F and G. The subclass of the seven mAb was IgM, IgM, IgM, IgG2b, IgG1, IgG1 and IgG1 respectively. The seven mAb could specifically react with insulin derived from human, cattle or pig in sandwich ELISA. The specific reaction of each mAb with recombinant human proinsulin analog was confermed by immunoblotting assay, only one stained protein band appeared on the transferred film.Conclusion The seven mAb are immunological specific to insulin derived from human, cattle or swine, and are available to the detection and purification of insulin.
【Key words】 monoclonal antibody (mAb); insulin; recombinant human proinsulin analog
胰岛素是具有重要生理功能的一种多肽类激素，在治疗糖尿病方面具有重要用途。胰岛素抗体是胰岛素测定和纯化所必需的免疫学试剂。为此进行了本研究。
1 材料与方法
1.1 菌种、质粒和细胞 大肠杆菌JM109、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞系、含有λ噬菌体PRPL串联启动子的人胰岛素原类似物（BKRA）基因表达质粒pBV- BKRA由本课题组构建和保存［1］。
1.2 免疫血清的制备 收集大肠杆菌JM109培养物，离心沉淀菌体，用超声波破碎，加福氏佐剂乳化后，经皮下注射免疫兔，制备JM109免疫血清。
1.3 重组人胰岛素原类似物的制备 用pBV-
BKRA转化JM109［1〗。取单个菌落，30℃培养14h，以20%接种在含卡那霉素（Kan）的新鲜LB培养液中，42℃振荡培养4h，高速离心沉淀菌体。参照文献［2〗分离包涵体，用二硝基苯磺酸钠处理［3〗后作为BALB/c小鼠免疫抗原。
1.4 免疫鼠 将制备的重组人胰岛素原类似物与等量福氏完全佐剂混合乳化，经腹腔注射免疫6周龄的BALB/c小鼠，20mg/（次·只），免疫2次，间隔2周。在细胞融合前3～4天, 加强免疫1次。
1.5 细胞融合 参照文献［4〗，用免疫的BALB/c小鼠制备脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。
1.6 杂交瘤细胞的筛选与克隆化 采用间接抑制ELISA方法。用重组人胰岛素原类似物包被ELISA反应板，10%的JM109免疫血清封闭，加入杂交瘤细胞培养上清液与之反应，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG反应，显色。从两次检测均为阳性的杂交瘤细胞孔中选取7个阳性孔，用有限稀释法进行克隆化。
1.7 单克隆抗体的制备 将单克隆化的阳性杂交瘤细胞扩大培养，按5×106/只的细胞量注射于7～10天前预先腹腔注射无菌液状石蜡的BALB/c小鼠腹腔内，诱生腹水，制备mAb。
1.8 单克隆抗体的效价 用重组人胰岛素原类似物包被ELISA反应板，以常规间接ELISA分别测定各单克隆化的杂交瘤细胞培养上清液和诱生腹水中的mAb效价。
1.9 单克隆抗体的鉴定
1.9.1 亚类 将浓缩10倍以上的杂交瘤细胞培养上清液或杂交瘤细胞诱生腹水，用抗鼠Ig亚类血清（Sigma产品），以琼脂双扩散试验鉴定mAb的亚类。
1.9.2 特异性
1.9.2.1 夹心ELISA 用7株mAb作为捕捉抗体分别包被ELISA反应板，以人胰岛素（Sigma产品）、牛胰岛素（Sigma产品）、猪胰岛素（南京生化制药厂产品）作为被捕捉物分别与之反应，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗胰岛素单克隆抗体（Sigma产品）反应显色，检验7株mAb能否捕捉胰岛素。
1.9.2.2 免疫印迹试验 采用免疫印迹法［5〗分析。重组菌诱导表达后，将菌体进行SDS-PAGE，电泳转移到硝酸纤维素膜上，用7株mAb分别与转移膜反应后，再加碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗鼠IgG与转移膜反应，显色。实验同步设立JM109菌与pBV220转化菌对照。
2 结果
2.1 重组人胰岛素原类似物的制备 用SDS-PAGE和凝胶扫描分析，包涵体中重组人胰岛素原类似物的含量达到80%（图1）。 图1 pBV-BKRA的诱导表达与mAb表达（略）
2.2 细胞融合与克隆化 融合细胞的阳性率为2.4%（7/288）。从中选取7个阳性孔进行克隆化，经3次克隆后，所有细胞生长孔均呈阳性反应。
2.3 单克隆抗体的效价和亚类 间接ELISA法测定7株mAb细胞培养上清液中的抗体效价为102，而诱生腹水中的抗体效价达到105～106。Ig亚类鉴定结果见表1。表1 7株抗胰岛素mAb的效价和Ig亚类（略）
2.4 单克隆抗体的特异性 在夹心ELISA试验中，7株mAb均能捕捉到人、牛和猪胰岛素；在免疫印迹试验中，7株mAb均能与重组人胰岛素原类似物（分子量12KD）结合呈现一条蛋白印迹带（图1-A～G）。表明用重组人胰岛素原类似物免疫制备的7株mAb对人、牛和猪胰岛素均具有特异的免疫反应性。
3 讨论
本实验用重组人胰岛素原类似物免疫BALB/c鼠，成功地获得了7株抗胰岛素mAb，可与人、牛、猪胰岛素发生特异性免疫反应，为胰岛素的测定和纯化增加了新的抗体选择。
制备天然胰岛素纯品比较困难。因此，本实验用重组人胰岛素原类似物作为免疫抗原，制备和纯化过程简便，在免疫前，对其用二硝基苯磺酸钠进行了处理，目的是提高免疫原性［3〗、增强BALB/c鼠的免疫反应；在筛选检测时采用了同源宿主菌免疫血清抑制ELISA，以降低或消除筛选检测过程中的非特异性反应。结果表明，以上措施对提高实验效率是有裨益的。
【参考文献】
1 房德兴，王永山，周宗安，等. 人胰岛素原类似物（BKRA）基因的合成与表达. 中国生物化学与分子生物学学报，1998，14（5）：518-524.
2 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993，380.
3 朱平，冯书章. 抗体实验技术. 长春：长春出版社，1994，117-118.
4 刘秀梵. 单克隆抗体在农业上的应用. 合肥：安徽科学技术出版社，1994，30.
5 金冬雁, 黎孟枫, 侯云德,译. 分子克隆实验指南,第2版.北京：科学出版社，1992，889-897.
作者单位：1 210002 江苏南京，南京军区疾病预防控制中心，南京军区军事医学研究所
2 210002 江苏南京，南京军区联勤部门诊部
(编辑：邓 锋)