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【摘要】 目的 确定半夏配方颗粒的最佳提取工艺，建立半夏配方颗粒中总生物碱的含量测定方法。方法 设计L9（34）正交试验确定最佳水提工艺；紫外分光光度法测定总生物碱含量。结果 最佳提取工艺：8倍量水，微沸回流1.5h，回流3次，总生物碱转移率为75.3 %，得膏率为35.8 %。半夏配方颗粒中总生物碱的含量为0.01989%。结论 本实验提供的半夏配方颗粒药学基础数据可靠，可在此基础上进行放大实验。
【关键词】 半夏；配方颗粒；总生物碱；紫外分光光度法；含量测定
半夏配方颗粒是半夏饮片经水提、浓缩、干燥、制粒等工序制成的单味中药配方颗粒剂。半夏来源于天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb.）Breit.的干燥块茎，主产于四川、湖北、江苏、安徽等地。半夏味辛，性温，有毒，归脾、胃、肺经，能够燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结。半夏含半夏淀粉、生物碱、半夏蛋白、氨基酸、胆碱等。其中生物碱是半夏块茎的生理活性的主要物质, 有镇吐、抗心律失常、抗坏血酸、抗肿瘤和提高记忆之功效。半夏对咳嗽中枢有镇静作用，可解除支气管痉挛，并使支气管分泌减少而有镇咳祛痰作用；可抑制呕吐中枢而止呕；半夏还具有抗溃疡、抗血栓形成、抗抑郁的作用。2005年版《中国药典》对半夏的质控没有作定量的要求，根据文献报导生物碱是半夏的主要活性成分，本实验采用符合《中国药典》规定的半夏，根据半夏的出膏率和总生物碱的转移率对半夏进行优化提取，并对半夏配方颗粒的制备及含量测定进行研究。
1 仪器与试药
1.1 仪器 SHIMADZU UV2450分光光度仪（日本岛津公司），DZG-401电热真空干燥箱（天津天宇实验仪器公司），AS20500AT超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），Sartorius BS210S型电子天平（北京赛多利斯仪器公司），SZ-93自动双重水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），202型电热恒温干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）。
1.2 试药 三氯甲烷、乙腈、糊精及其他试剂均为分析纯。药品：半夏饮片购于河北安国药材市场；盐酸麻黄碱对照品购于中国药品生物制品检定所。
2 方法
2.1 半夏配方颗粒制备工艺优选
2.1.1 实验因素水平 根据半夏中主要有效成分总生物碱的水溶性及预试验结果，确定以总生物碱的含量和得膏率为指标，以加水量、提取时间、提取次数进行正交实验，选择L9（34）正交表，对水提工艺的各参数进行考察，因素水平表如表1。表1 半夏提取因素水平表
2.1.2 半夏总生物碱标准曲线的绘制 精密称取盐酸麻黄碱对照品5.16mg置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。分别精密吸取该溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8ml置于分液漏斗中，加水至2.0ml，再加入20ml pH6.0柠檬酸钠缓冲液20ml，三氯甲烷20ml，1％溴麝香草酚蓝溶液2ml，充分振摇，静置0.5h，分取三氯甲烷层，以三氯甲烷为空白对照，在414nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，麻黄碱浓度C（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，见图1。
计算得回归方程为A = 0.07715C + 0.05554 R=0.9994
结果表明，盐酸麻黄碱在1.03～9.29μg/ml 范围内呈良好的线性关系。
图1 标准曲线2.1.3 供试品溶液的制备 按照正交设计方案，分别称取9份半夏饮片，各25g，分别加入相应倍量的自来水，微沸回流提取，过滤，合并滤液，摇匀。取正交实验所得过滤液适量，减压浓缩至干，加水2ml，再加入20ml pH为6.0的柠檬酸钠缓冲液20ml，三氯甲烷20ml，1％溴麝香草酚蓝溶液2ml，充分振摇，静置0.5h，分取三氯甲烷层，以三氯甲烷为空白对照，在414nm处测定吸光度，计算总生物碱量。紫外分光光度法分别测定9次试验提取物中总生物碱的含量和半夏饮片中总生物碱含量，计算其提取率。
2.1.4 对照品溶液的制备 精密称定盐酸麻黄碱对照品适量，置50ml量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度摇匀，制成每1ml含103.2μg/ml的溶液，即得。
2.1.5 半夏药材中半夏总生物碱的含量测定 取本品粉末（过三号筛）约1.15g，精密称定，加75%乙醇10ml，浓盐酸1ml，回流提取3h，过滤。残渣以75%乙醇洗涤，过滤，合并滤液与洗涤液，80℃下回收乙醇至干，残渣加pH6.0柠檬酸钠缓冲液20ml，三氯甲烷20ml，1％溴麝香草酚蓝溶液2ml，充分振摇，静置0.5h，分取三氯甲烷层，以三氯甲烷为空白对照，在414nm处测定吸光度。计算药材中生物碱的含量是0.0186%。
2.1.6 样品液含量测定 吸取上述供试品溶液与对照品溶液，以三氯甲烷为空白对照，在414nm处测定吸光度，计算，即得。
2.2 半夏配方颗粒的成型 以半夏配方颗粒优选后的工艺，取半夏药材1500g，加8倍量水，回流提取3次，每次1.5h。滤过，合并滤液，减压浓缩，合并滤液，水浴浓缩成浸膏，65℃下减压干燥成干浸膏，将干浸膏粉碎，过80目筛，称重，按照干浸膏和辅料比为1:1加入糊精，用90%的乙醇适量制成软材，软材过10目筛，65℃减压干燥4h，10目筛整粒，即得半夏配方颗粒1065g。
2.3 半夏配方颗粒总生物碱含量测定研究
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸麻黄碱对照品5.16mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。
2.3.2 供试品溶液制备 取本品约0.4g，精密称定，置250ml烧瓶中，加2.5mol/L硫酸溶液30ml，三氯甲烷50ml，加热回流2h，放冷，分出三氯甲烷层，再加20ml;三氯甲烷洗涤水层，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣用甲醇定量转移至10ml量瓶中，摇匀，即得。
2.3.3 阴性对照液的制备 取按本品制备工艺制备的“缺半夏药材的阴性对照品”即乳糖0.2g，于25ml量瓶中，加甲醇20ml，超声处理20min，放冷，甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液，即得。
2.3.4 标准曲线的绘制（见2.1.2）
2.3.5 测定法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液，以三氯甲烷为空白对照，在414nm处测定吸光度，即得。
2.3.6 阴性对照实验 分别吸取上述半夏总生物碱对照品溶液、阴性对照品溶液、供试品溶液，在上述条件进行吸光度测定。结果表明：阴性对照无干扰。
2.3.7 中试成品的测定 称取不同批号半夏配方颗粒约1g，精密称定，按以上供试品溶液制备方法制备供试品溶液，照上述色谱条件测定计算。
3 结果
3.1 半夏总生物碱转移率测定结果 由方差分析结果可知：因素A、B和C对出膏率均无显著性影响（见表2）；因素B对总生物碱提取转移率有显著性影响（见表3），结合直观分析结果，确定最佳提取工艺为A1B3C3，即每次用药材量的8倍水,提取3次,每次提取1.5h。表2 方差分析表表3 正交实验结果
3.2 半夏总生物碱转移率考察验证实验 为了进一步验证所选条件的正确性与科学性，增加所选的最佳工艺的可信度，安排了3个验证实验，结果见表4。表4 半夏提取工艺验证实验结果
3.3 半夏配方颗粒（中试成品）总生物碱含量测定 结果见表5。
4 讨论
4.1 提取溶剂的选择 《中国药典》2005年版没有对半夏进行定量质控，根据文献报道半夏中总生物碱是它的主要活性成分，且半夏总生物碱水溶性很好，颗粒剂是与传统汤剂作对比研制的改变剂型的新药，所以本实验中采取水作为提取溶剂，半夏总生物碱转移率达75%以上，得膏率35%以上。这既保证了配方颗粒中半夏总生物碱含量又能尽可能地保证其他水溶性成分的量，并且工业生产简便易行，因此是较合适的提取方法表5 成品含量测定结果
4.2 最佳工艺的确定 在许多正交优化试验中，当有两项评价指标时往往采取两项指标加权评分的方法确定最佳工艺，该方法在两项指标变化趋势情况不一致时更显出它的优越性，但两项指标的权重比并没有权威理论的指导，完全是经验确定的，因为针对不同类药材，药典中规定的药理活性成分和总体提取物（得膏）二者对最终产品药效的影响孰大孰小不能一概而论。在本实验中没有引入权重的概念，因为提取率和得膏率两项指标的变化趋势是一致的，亦即有利于半夏总生物碱转移率的提取工艺，其得膏率也较高。因此最终选择上述最佳工艺。
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作者单位：1 300072 天津，天津大学药物科学与技术学院 （△通讯作者）2 300193 天津，天津药物研究院