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【摘要】 目的 探讨不同照射方式对不同细胞系所产生的旁效应。方法 采用人正常淋巴（NL）细胞系和人慢性髓细胞白血病（K562）细胞系，60Coγ射线分别照射细胞和照射培养液；照射方式分为2.0Gy一次照射及2.0Gy（1.0Gy×2）分两次照射，两次照射间隔时间为2h，照射剂量率为1.0Gy/min。结果 2.0Gy一次照射和2.0Gy(1.0Gy×2)分两次照射的单纯照射培养液组的凋亡细胞发生率T检验显著高于未照射的对照组（P<0.05);辐射诱发人NL凋亡细胞发射率显著高于人K562细胞。结论 单纯照射的培养液同样可以诱发凋亡细胞发生率增加；不同的细胞系在辐射诱发的旁效应存在差别。
【关键词】 电离辐射；辐射诱发旁效应；凋亡
电离辐射诱发旁效应在20世纪90年代初期首先被Nagasawa H等［1］报道。他们研究发现，用α粒子照射只有1%的细胞，结果有30%～50%的细胞发生了姊妹染色体互换，这一发现也被以后的许多学者陆续证实，并且对旁效应现象的发生机制做了大量的研究，进一步证实辐射诱发旁效应主要是通过受照射损伤细胞分泌细胞因子，以及与细胞之间的缝隙联结细胞间通讯有关［2，3］。但是对于旁效应的实验研究，使用肿瘤细胞的实验较多，本文将采用正常人的淋巴细胞系和慢性髓性白血病细胞系，利用低传能线密度的60Coγ射线中等剂量照射，观察两种细胞系在辐射诱发旁效应间之间是否存在区别。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系 正常人淋巴（NL）细胞系，由本所放射生物研究室自行传代建立的正常男性淋巴细胞系；人慢性髓细胞白血病（K562）细胞系，也是国内实验室一直使用的细胞系，由本所毒理实验室提供。
1.1.2 照射 60Coγ射线照射，吸收剂量率为1.0Gy/min，照射技术及照射条件由本所二级标准实验室提供。
1.1.3 凋亡细胞检测 凋亡细胞检测试剂盒由北京宝赛生物技术有限公司生产。流式细胞仪由美国BD公司生产，型号为FACS Aria,所用的软件FACS Diva。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 两种细胞相同条件下培养，用RPM 1640培养液，加10%胎牛血清，37℃、5%CO2培养，隔天换培养液1次，细胞生长良好后，更换培养液后次日照射，细胞数约为1×106左右，25cm2培养瓶加入5ml培养液。
1.2.2 照射条件 实验用60Coγ射线照射2.0Gy一次照射，2.0Gy分两次照射（1.0Gy×2），照射后立即放回37℃培养箱继续培养；二次照射的细胞，2h后，按同样方法处理。
1.2.3 细胞分组 将NL和K562两种细胞分别进行2.0Gy一次照射、2.0Gy分次照射（1.0Gy×2），各分为7组，未照射的正常对照组，细胞和培养液完全照射组，提取培养液照射组（照射后的细胞悬液在60min内，用10ml注射器吸出，连接在0.2μm过滤漏斗过滤细胞，将照射的培养液加入到未经照射的细胞中）和50%细胞和培养液（照射的细胞悬液等比例加入到未照射的细胞悬液中）照射组，37℃、5%CO2培养箱继续培养。
1.2.4 凋亡细胞检测 分别于照射后的24、48和72h进行凋亡细胞检测，检测方法按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒的说明书进行操作，调整细胞浓度至1×１０6左右，PBS洗2次，低温低速离心10min，用尼龙布过滤，尽量使细胞悬液中的细胞成单个细胞，将细胞悬浮于缓冲液中，上机前30min加入荧光探针（Annexin V-FITC)和碘化丙啶（propidium iodide)染料，闭光4℃反应30min后加入缓冲液（binding buffer),充分振荡混匀上机检测，用软件FACS Diva计算凋亡细胞率，为了避免其他混杂因素，本次实验只计数早期凋亡细胞率，除去晚期凋亡细胞和死亡细胞。
该实验在相同条件下重复2次，每个检测点检测3瓶细胞，求出3次检测早期凋亡细胞率的平均值。
1.2.5 数据统计分析 各组凋亡细胞发生率采用照射组与未照射组之间进行比较，2.0Gy一次照射和2.0Gy（1.0Gy×2）分两次照射之间比较，以及两种细胞系凋亡细胞发生率，采用相同照射条件组之间比较，都采用t检验。50%细胞照射组凋亡细胞发生率的预期值的计算是用完全照射组凋亡细胞发生率加上正常对照组凋亡细胞发生率后，再除以2，计算50%细胞照射组凋亡细胞发生率的预期值。
2 结果
细胞照射后不同时间，取出不同组的细胞，经过前处理后上机，检测凋亡细胞发生率，观察在照射后不同时间凋亡细胞发生率。
2.1 NL细胞 2.0Gy照射后，24和48h，早期凋亡细胞发生率各组与对照组相比都有所增加，特别是提取照射细胞的培养液组在照射后24h和48h与未照射的对照组比较差异有显著性；各时间点的50%细胞照射组早期凋亡细胞发生率都高于预期值（完全照射组凋亡细胞发生率的50%+未照射对照组凋亡细胞率的50%）；而72h后只有完全照射组显著高于未照射对照组；另外两组的凋亡细胞发生率与未照射的对照组间比较差异均无显著性。
2.2 正常人淋巴（NL）细胞1.0Gy×2照射后24h和48h凋亡细胞发生率都比对照组有所升高，t检验与对照组之间比较差异有显著性；同样，24h和48h的50%细胞照射组早期凋亡细胞发生率都高于预期值；另外，只有照射后72h的完全照射组与未照射的对照组t检验差异有显著性。 表1 60Coγ射线2.0Gy和1.0Gy×2照射正常淋巴（NL）凋亡细胞发生率注：照射组与未照射对照组之间*P<0.05;照射组与未照射对照组之间ΔP<0.01
2.3 正常人淋巴细胞（NL）在相同照射剂量，不同照射方式采用一次2.0Gy一次照射和2.0Gy（1.0Gy×2）分两次照射之间的比较结果显示：各组之间差异均无显著性，包括总凋亡发生率差异也无显著性。结果见表1。
2.4 K562细胞系在2.0Gy照射后24h，早期凋亡细胞发生率t检验都显著高于未照射的对照组；完全照射组和50%细胞照射组48h后早期凋亡细胞发生率t检验显著高于未照射对照组；24h和48h的50%细胞照射组早期凋亡细胞发生率都高于预期值；而在72h后早期凋亡细胞发生率t检验各组之间差异均无显著性。表2 60Coγ射线2.0Gy和1.0Gy×2照射髓性白血病（K562）凋亡细胞发生率注：照射组与未照射对照组之间t检验*P<0.05;照射组与未照射对照组之间t检验ΔP<0.01
2.5 K562细胞60Coγ1.0Gy×2照射后24h各组与未照射的对照组t检验差异有显著性；只有24h的50%细胞照射组早期凋亡细胞发生率高于预期值；照射后48h和72h各组与对照组之间t检验差异均无显著性。
2.6 相同照射剂量，采用两种2.0Gy一次和2.0Gy（1.0Gy×2）分次照射的K562细胞，早期凋亡细胞发生率t检验各组之间差异均无显著性。结果见表2。
2.7 两种细胞系的辐射敏感性比较，60Coγ射线2.0Gy一次和1.0Gy×2分次照射后，NL细胞辐射敏感性和旁效应的发生率与K562细胞比较，总趋势都有所升高，t检验只有照射后48h和1.0Gy×2的50%细胞照射组的NL细胞早期凋亡细胞发射率显著高于K562细胞，其余各组t检验差异无显著性。
3 讨论
射线照射引起的旁效应，就是在细胞没有直接受到射线的穿过而引起的生物学效应结果，这一现象，在人类和啮齿动物培养的细胞系中被大量研究所证实，受到国内外学者的广泛关注，同时也做了大量深入的实验研究，对这一现象的发生有了不断的新的认识。有学者认为产生旁效应作用的程度与放射线的传能线密度（LET）和细胞系的种类有关［4］，用4.7和100keV两种传能线密度（LET）精确的带电粒子微束照射新生儿的皮肤成纤维细胞系，高LET照射细胞未见到产生旁效应。笔者的实验是采用两种人的细胞系，发现NL细胞2.0Gy一次照射和1.0Gy×2分次照射后细胞凋亡发生率大部分组都高于K562细胞系凋亡发生率，两种细胞系未照射细胞的正常对照组凋亡发生率基本相同，进一步说明射线照射引起细胞凋亡与细胞系的种类有关。
50%细胞照射组的细胞凋亡发生率显著高于期望值，提示产生旁效应既有细胞间的信息传递，也有细胞受照后释放到培养基的介质中的物质信息的相互传递有关。笔者的实验还发现NL细胞所提取照射细胞培养液组无论是2.0Gy一次照射和2.0Gy（1.0Gy×2）分次照射，凋亡细胞发生率都显著高于未照射的对照组。同样，K562细胞在所提取照射细胞培养液组2.0Gy一次照射和1.0Gy×2分次照射早期凋亡细胞的发生率显著高于对照组，特别是单纯照射培养液组细胞早期凋亡细胞的发生率也显著高于未照射的对照组。而且随着时间的推移逐渐减低，这一结果进一步证实了射线照射后可溶性因子传递损伤信号和缝隙联结的结论。旁效应的发生率随着照射后时间的延长而减低。
我们的实验还发现，在照射后不同时间，凋亡细胞的发生率也在发生变化，两种细胞系早期细胞凋亡的发生率同样随着照射后时间的延长而逐渐减低。NL细胞在照射后72h，凋亡细胞的发生率与未照射的正常对照组接近，并且没有统计学意义。K562细胞而在照射后48h和72h的凋亡发生率就与未照射的正常对照组接近。同样，说明细胞系不同，引起旁效应物质的作用时间也不尽相同。正常细胞系的旁效应发生率高于肿瘤细胞旁效应的发生率，这种结果未见到相关报道，有待于研究进一步证实。
美国哥伦比亚大学的Zhu A等［5］最近的研究发现用α粒子照射小鼠胚胎干细胞，发现Rad 9基因有修复辐射损伤的作用，在缺乏Rad 9基因的细胞诱发细胞旁效应引起的细胞凋亡和细胞微核率要明显增高，认为辐射诱发旁效应与抗辐射基因的存在有关。另对引起旁效应机制的研究显示与氧循环通路有关［6］。特别是美国哥伦比亚大学的学者最近的研究显示认为前列腺素过氧化物酶在产生旁效应过程中扮演重要角色，减少前列腺素过氧化物酶的活性氧可以减少旁效应，笔者的实验所用两种细胞系是否存在国外学者证实的差别，有待于另外的研究加以证实。
另外，我们的实验结果显示NL细胞K562细胞在2.0Gy一次照射和2.0Gy（1.0Gy×2）分次照射各组之间凋亡细胞发生率差异均无显著性，与以往的实验结果有所不同，可能是由于分次照射时间间隔太近所致，有待于进一步研究证实。
（致谢：60Coγ射线照射得到我所二级标准实验室姜庆寰、刘雅的支持；细胞系来源得到涂序珉、刘青杰、封江彬、陆雪的帮助；流式细胞检测得到刘建香、黄敏艳、阮建磊的大力支持；一并感谢。）
【参考文献】
1 Nagasawa H,Little JB.Induction of sister chromatid exchanges by extremely low dose of alpha particles.Cancer Res,1992,52(22):6394-6396.
2 Azzam EI,de Toledo SM,Little JB.Direct evidence for the participation of gap junction mediated intercellular communication in the transmission of damage signals from alpha-particle irradiated to non-irradiated cells.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(2):473-478.
3 Little JB.Cellular radiation effects and the bystander response.Mutat Res,2006,597:113-118.
4 Frankenberg D,Greif KD,Giesen U.Radiation response of primary human skin fibroblasts and their bystander cells after exposure to counted particles at low and high LET.Int J Radiat Biol,2006,82(1):59-67.
5 Zhu A,Zhou H,Leloup C,et al.Differential impact of mouse Rad 9 deletion on ionizing radiation-induced bystander effects.Radiat Res,2005,164(5):655-661.
6 Zhou H,Ivanov VN,Gillespie CR,et al.Mechanism of radiation-induced bystander effect:role of the cyclooxygenase-2 signaling pathway.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(4):14641-14646.
作者单位：100088 北京，中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所