自体树突细胞疫苗联合干扰素治疗慢性乙型肝炎的临床研究*

【摘要】  目的 探讨自体树突状细胞（dendritic cell,DC)疫苗联合干扰素治疗慢性乙型肝炎的临床疗效和安全性。方法 体外培养扩增DC至第6天，HBsAg致敏形成特异性DC疫苗备用。选择HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者66例，随机分为联合治疗组：30例，给予干扰素α-2b 500万单位，肌注，隔日1次，疗程24周，同时联合DC疫苗回输治疗，每回输两次为1个疗程（中间间隔2周），每疗程间隔1个月，共进行3个疗程。干扰素治疗组：36例，单独给予干扰素α-2b 500万单位，肌注，隔日1次，疗程24周。两组治疗结束后均随访12周。结果 联合治疗组和干扰素治疗组治疗前后的ALT复常率均达50%以上（P>0.05)，差异无显著性。而联合治疗组HBV-DNA抑制率和HBeAg阴转率均高于干扰素治疗组（P<0.05)，有统计学意义。结论 自体树突细胞疫苗联合干扰素治疗HBeAg阳性的慢性乙型肝炎效果优于单独干扰素治疗。

【关键词】  树突状细胞；疫苗；干扰素a-2b；肝炎病毒；乙型

    树突状细胞（dendritic cell,DC)是起源于骨髓的专职抗原提呈细胞（antigen pressenting cell,APC)，具有启动T细胞介导的免疫应答功能，最早由Steinman和Cohn首次于1973年发现，因其细胞形态上具有众多树突状突起而得名。目前已发现了许多疾病的发生与转归都与DC有关。随着对DC的体外分离、扩增和培养技术等基础研究的不断成熟，DC疫苗在肿瘤、自身免疫性疾病和慢性肝炎的治疗中引起人们的广泛关注。本研究将自体DC经HBsAg致敏形成的特异性DC疫苗与干扰素联合应用，观察治疗HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者的疗效和安全性。

    1  资料与方法

    1.1  研究对象  为我院肝病中心2005年10月～2006年9月，门诊或住院的慢性乙型肝炎患者66例，诊断均符合2000年西安中华医学会传染病与寄生虫病学会及肝病学会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准［1］。其中男45例，女21例；年龄18.5～49.3岁，平均33.2±15.7岁；病程9个月～15年，平均8.6±7.1年。病例纳入标准：（1）血清HBsAg阳性半年以上，且HBeAg阳性，HBcAb阳性；（2）血清HBV-DNA≥1×105copies/ml，血清ALT在正常值上限的2～5倍之间，TBil低于正常值上限的2倍，凝血酶原活动度（PTA）大于60%；（3）依从性好；（4）6个月内未用任何抗病毒药物及免疫调节药物治疗。排除对象：血清抗-HCV、抗-HIV阳性者；自身免疫性疾病者；有明显的心、脑、肾损伤者；甲状腺功能异常者；有血液病、糖尿病、酗酒和吸毒史者；妊娠和哺乳期妇女。

    1.2  研究方法

    1.2.1  主要仪器和试剂  CO2培养箱（Thermo Forma,美国），倒置显微镜（Olympus，日本）,流式细胞仪（Coulter,美国），全自动酶标仪（Thermo，芬兰）。主要试剂：rhGM-CSF、rhIL-4、RPMI1640培养液、鼠抗人CD4，CD8，均购自河北博海生物工程有限公司。HBsAg购自中国预防医学科学院病毒所。

    1.2.2  DC疫苗体外培养  在无菌条件下抽取受试者外周静脉血20ml，肝素抗凝，在百级试验室进行下面操作，生理盐水1：1稀释抗凝血，层加到淋巴细胞分离液2000r/min离心30min，分离出外周血单核细胞并计数，用1640液洗2次，再加入含有体积分数15%人AB型血清的1640完全培养基重悬细胞。以2×106/ml的细胞浓度加入一次性6孔培养板中，于37℃、5%CO2饱和湿度下培养4h，吸弃上清液，再用1640培养液轻洗2次，除去非贴壁细胞，加入含500U/ml rhGM-CSF和500U/ml rhIL-4的完全培养基，隔日换液，培养至第6天再加入终浓度2.5μg/ml的HBsAg，4h后加入终浓度为10ng/ml的TNF，继续在37℃、5%CO2饱和湿度下培养1天，收获DC疫苗；用生理盐水洗涤2次并计数，即刻在受试者腋下部位常规消毒后经皮下注入体内。

    1.2.3  治疗方法  将66例入选患者采用随机对照方法分为：联合治疗组：30例，给予干扰素α-2b（安福隆，天津华立达生物工程有限公司）500万单位，肌注，隔日1次，疗程24周，同时联合DC疫苗回输治疗，每回输两次为1个疗程（中间间隔2周），每个疗程间隔1个月，共进行3个疗程。干扰素治疗组：36例，单独给予干扰素α-2b 500万单位，肌注，隔日1次，疗程24周。两组治疗结束后均随访12周。

    1.2.4  观察指标  分别于治疗前、治疗24周结束时、随访12周时，检测血常规、肝功能、乙肝五项、HBV-DNA定量、肾功能、甲状腺功能、记录与治疗有关的一切不良事件。

    1.2.5  检测方法  肝功能检测采用瑞士全自动生化分析仪，血清HBV标记物检测采用ELISA法，HBV-DNA检测采用PCR法，以HBV-DNA≥1×103copies/ml为阳性。

    1.3  统计学方法  计数资料用χ2检验，进行t检验。全部资料用SPSS 10.5软件包处理。

    1.4  伦理学  本研究经河北医科大学第一医院医学伦理委员会批准，并获得所有患者签署的知情同意书。

    2  结果

    2.1  疗效分析

    2.1.1  治疗结束时联合治疗组与干扰素组的疗效比较  联合治疗组和干扰素组的ALT复常率分别为63.33%和58.33%（P>0.05)，差异无显著性。联合治疗组HBV-DNA抑制率、HBeAg阴转率分别为60.00%、33.33%，均高于干扰素组的33.33%、25.00%(P<0.05)，差异有显著性。结果见表1。

    2.1.2  随访结束时联合治疗组与干扰素组的疗效比较  联合治疗组HBV-DNA抑制率、HBeAg阴转率分别为53.33%、36.67%，优于干扰素治疗组的30.56%、13.89%(P<0.05)，差异有显著性，而两组ALT复常率比较，差异无显著性（P>0.05)。结果见表2。表1  治疗结束时联合治疗组与干扰素组的疗效比较表2  随访结束时联合治疗组与干扰素组的疗效比较

    2.2  安全性分析  联合治疗组和干扰素组出现了相同的不良事件，主要是流感样不适、发热、全身乏力、头痛、恶心、白细胞减少，随治疗时间的延长而减轻，患者对治疗的依从性良好，治疗过程中未出现皮疹、过敏反应、黄疸和肝功能的严重损害。两组不良反应发生率分别为84.8%和79.5%。结果显示两组间差异无统计学意义（P>0.05)，表明DC疫苗回输未增加不良反应的发生。

    2.3  治疗期间HBV-DNA定量的变化  治疗期间随着治疗时间的延长，两组患者血清HBV-DNA中线水平呈进行性下降，并在治疗终点的24周达最低点。疗程结束时，治疗组HBV-DNA定量平均下降2.23log10copies/ml，与对照组平均下降1.65log10copies/ml比较P<0.05。

    3  讨论

    研究发现，产生有效的细胞免疫是机体控制病毒感染和清除病毒的重要方式，而慢性肝炎患者免疫功能低下，不能产生有效的特异性细胞毒性T细胞反应（CTL），使患者长期处于带毒状态，产生慢性炎症损伤，造成病情迁延不愈，甚至发展成为肝硬化、肝癌［3］。DC作为体内最强的APC，在诱导HBV特异性CTL反应中起重要作用。大量研究表明，DC的成熟缺陷，提呈抗原功能低下，是导致慢性病毒性肝炎患者长期带毒状态的重要机制之一［4］。因此诱导机体产生强大的、多特异的、多克隆细胞免疫，将成为治疗慢性乙型肝炎的有效手段［5］。

    从慢性乙型肝炎病人外周血培养的DC疫苗对HBsAg有较强的递呈能力，故采用自体DC疫苗治疗慢性乙型肝炎，可抑制HBV的复制，减少体内病毒的载量，促进HBeAg/抗HBe的血清转换［6］。张书广等［7］探讨自体乙型肝炎疫苗致敏的DC治疗慢性乙型肝炎，结果显示，治疗后的HBV-DNA含量拷贝数均较对照组显著降低。娄海山等［8］采用HBV-S抗原肽致敏的DC皮下注射治疗CHB，也取得了较好的疗效。

    干扰素是治疗慢性乙型肝炎的首选药物，荟萃分析表明，HBeAg阳性的慢性乙型肝炎，经普通干扰素治疗4～6个月后，HBV-DNA转阴率为37%，HBeAg转阴率为33%，HBsAg转阴率为7.8%，其疗效与ALT基线水平有关［2］，故单一应用干扰素治疗慢性乙型肝炎临床效果欠佳。

    近年来，随着DC的分离和培养技术的日臻完善，DC基础和临床研究的逐渐深入，人们力求通过提高慢性乙型肝炎患者外周血DC的表面分子表达，增强其抗原提呈能力，以提高治疗慢性乙型肝炎的效果。

    本研究比较了自体DC疫苗回输联合干扰素治疗和单独干扰素治疗HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者66例，结果显示：联合治疗组和干扰素治疗组在治疗结束和随访结束时的ALT复常率均达50%以上，无统计学意义，联合治疗组在治疗结束和随访结束时的HBV-DNA抑制率分别为60.00%和55.33%，而干扰素组的HBV-DNA抑制率分别为33.33%和30.56%，两组比较有统计学意义（P<0.05)。联合治疗组在治疗结束和随访结束时的HBeAg阴转率分别为33.33%和36.67%，均高于干扰素组的25.00%和13.89%，两组比较有统计学意义（P<0.05)。

    通过对病毒动态观察表明，联合治疗组和干扰素组均可使HBV-DNA定量拷贝数下降，前者在各时间点与基线相比的平均病毒下降量均多于后者，在治疗24周时联合治疗组血清中HBV-DNA定量平均下降2.23log10copies/ml，明显高于干扰素组的1.65log10copies/ml。并且联合治疗组于随访结束时能保持HBV-DNA的持续降低，而干扰素组有15.38%（2/13）出现HBV-DNA反弹。

    慢性乙型肝炎的治疗目前仍为世界性难题，我们在参考国内外最新研究成果后，通过应用自体DC疫苗回输联合干扰素治疗HBeAg阳性的慢性乙型肝炎有效地提高HBV-DNA抑制率和HBeAg阴转率，效果优于单独应用干扰素治疗。今后DC疫苗的研究还将不断深入，而对HBeAg阴性的慢性乙型肝炎以及对乙肝病毒携带者的治疗作用仍在观察中，力求为提高治疗慢性乙型肝炎的疗效寻找出一条新的治疗途径。

【参考文献】
  1 中华医学会传染病与寄生虫病学分会和肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华传染病杂志，2001，19：56-62.

2 中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.中华肝脏病杂志，2005，13（12）：881-891.

3 Akbar SM,Furukawa S,Hasebe A,et al.Production and efficacy of a dendritic cell based therapeutic vaccine for murine chronic hapatitis B virus carrier.Int J Mol Int J Med,2004,14(2):295-299.

4 韩进超，臧国庆，余永胜，等.树突细胞的成熟状态和慢性病毒性肝炎.国外医学·流行病学传染病学分册，2005，32（1）：54-57.

5 Auffermann-Gretzinger S,Keeffe EB,Levy S.Impaired dendritic cell maturation in patients with chronic,but not resolved hepatitis C infection.Blood,2000,97(5):3171-3176.

6 李用国，陈敏，张大志，等.自体树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床研究.中华传染病杂志，2003，11（4）：206-208.

7 张书广，赵歧刚，李友忠，等.树突状疫苗的制备及治疗慢性乙型肝炎的临床研究的疗效观察.山东医药，2005，45（5）：7-9.

8 娄海山，白经修，习方明，等.树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎临床观察.中华传染病杂志，2005，23（3）：203-204.

作者单位：050031 河北石家庄，河北医科大学第一医院肝病中心