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【摘要】 目的 探讨树突状细胞（dendritic cells,DCs）活化的细胞毒T细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTLs）联合5-氟尿嘧啶（5-Fluorourac，5-FU）体内外对子宫颈癌的抑制作用。方法 用细胞因子从人外周血诱导DCs，MTT法检测DCs激活的CTLs联合5-FU体外对子宫颈癌细胞的抑制作用。皮下接种Hela细胞建立荷瘤裸鼠，实验分为CTLs治疗组、5-FU治疗组、CTLs联合5-FU治疗组，以生理盐水为对照。每3天腹腔注射1次，治疗21天，观察疗效。结果 CTLs联合5-FU在体外显著抑制癌细胞生长，其MTT检测结果低于其他实验组（P＜ 0.01）；在对裸鼠进行治疗的14天、21天，联合治疗组的肿瘤体积、瘤重明显小于其他实验组（P＜0.01）。结论 联合应用CTLs及5-FU较单纯使用CTLs或5-FU更有效。
【关键词】 树突状细胞 细胞毒T细胞 5-氟尿嘧啶 子宫颈癌
Inhibitive effect of CTLs actived by dendritic cells and combined with 5-FU on carcinoma cervicis in vitro and vivo
WANG Xiu-jin.Department of Neurology, Central Hospital of Jinzhou City, Liaoning 121000, China
【Abstract】 Objective To investigate the inhibitive effect of cytotoxic T lymphocytes （CTLs） actived by dendritic cells （DCs） and combined with 5-Fluorourac （5-FU） on carcinoma cervicis in vitro and vivo.Methods Cocultured with cytokines, DCs were obtained from human peripheral blood. Then the inhibitive effect of CTLs actived by DCs and combined with 5-FU on carcinoma cervicis was detested in vitro. In addition, human carcinoma cervicis Hela model was established in nude mice which were then divided into four groups：control group，CTLs group，5-FU group，and CTLs／5-FU group．The treatment results of each group were observed for 21 days. Results The inhibitive effect of CTLs／5-FU group on tumor cells was significantly increased as compared with CTLs and 5-FU groups （P<0.01） in vitro and vivo. After therapy for 14 and 21 days in vivo，the volume and weight of tumor of CTLs／5-FU group were significantly decreased as compared with CTLs and 5-FU groups （P<0.01）. Conclusions The inhibitive effect of CTLs combined with 5-FU obviously increases as compared with that of CTLs or 5-FU．
【Key words】 dendritic cells; cytotoxic T lymphocytes; 5-fluorourac; carcinoma cervicis
树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是机体功能最强的专职抗原提呈细胞，在启动、调节并维持免疫应答中起重要作用［1，2］。本实验观察DCs激活的细胞毒T细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTLs）联合5-氟尿嘧啶（5-Fluorourac，5-FU）在裸鼠体内外对子宫颈癌的抑制作用，意欲探索以DCs为基础的肿瘤免疫治疗联合化学治疗的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料 细胞因子（IL-4、GM-CSF）购自Glaco公司；Hela子宫颈癌细胞株购自北京医科大学；雄性BALB／c裸鼠8周龄，l8～20g，清洁型，购自中山医科大学；人外周血购自锦州中心血站。
1.2 方法
1.2.1 制备肿瘤抗原粗提物 取107个Hela细胞，加入1ml生理盐水，反复冻融3次后稀释到10ml，微孔滤膜过滤，4℃保存备用。
1.2.2 制备DCs及CTLs 分离人外周血单个核细胞，37℃孵育2h后，非贴壁细胞经尼龙毛柱孵育1h后冲洗出T细胞备用。贴壁细胞用含GM-CSF、IL-4的培养基培养，3天加入肿瘤抗原粗提物，7天收集悬浮细胞为DCs。DCs与T细胞按1：20的效靶比培养72h，收集CTLs。
1.2.3 体外实验 以Hela为靶细胞（5000细胞/孔）。实验分四组：CTLs治疗组（5×104/孔）、5-FU治疗组（5mg/L）、联合治疗组（CTLs加5-FU）、对照组（生理盐水）。72h后MTT法检测。
1.2.4 体内实验 皮下注射Hela（2×106/鼠）制备荷瘤鼠，随机分4组，每3天瘤内注射：50μl生理盐水（对照组）、10mg 5-FU（5-FU治疗组）、2×105个CTLs（CTLs治疗组）、10mg 5-FU加2×105个CTLs（联合治疗组），观察21天，测瘤体积（V=肿瘤最长径×最短径2/2）、瘤重。
1.2.5 统计学方法 应用SPSS11.0软件处理实验数据，所有数据用x±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 体外MTT检测结果 CTLs加5-FU联合治疗组（0.19±0.05）、CTLs 治疗组（0.45±0.07）、5-FU治疗组（0.40±0.06）均低于对照组（1.45±0.06）（P＜0.01）；联合治疗组低于单纯应用CTLs或5-FU治疗组（P＜0.01）。
2.2 体内实验 见表1。
表1 各组裸鼠治疗后瘤体积及瘤重比较注:a,b,c：分别为CTLs治疗组、5-FU治疗组、联合治疗组与对照组比较。P均＜0.01，差异有显著性；d,e：分别为联合治疗组与CTLs治疗组、5-FU治疗组比较。P均＜0.01，差异有显著性。
3 讨论
子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，临床以手术治疗为主。由于其术后五年生存率较低，而且容易复发甚至转移，因此，单一使用一种治疗手段往往难以解决问题。本实验将以DCs为基础的肿瘤免疫治疗与由5-FU介导的化学治疗相结合，体内外探讨其对肿瘤的抑制作用，以期探索一条更有效的肿瘤治疗途径。
机体的抗肿瘤免疫主要依赖由T细胞介导的细胞免疫，而体内的T细胞一般不具有杀伤活性。DCs能摄取、加工及处理抗原，并将抗原提呈给T细胞，使其活化成具有杀伤活性的CTLs，从而诱导抗肿瘤免疫［3］。5-FU 具有抑制肿瘤细胞胸腺嘧啶核苷酸合成酶、破坏DNA稳定性，从而抑制肿瘤细胞DNA合成的作用，本身即可杀死肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞的凋亡；此外，5-FU在体内可以转化为5-氟尿嘧啶核苷酸，从而渗入RNA，干扰蛋白质的合成，是目前肿瘤化疗中最普遍的药物之一［4，5］。本研究发现， CTLs及5-FU在体内外均能显著抑制及杀伤肿瘤细胞，抑制裸鼠移植瘤的生长，使肿瘤体积及重量显著降低，而且联合治疗组较单纯治疗组效果更佳。结果表明，联合应用以DC为基础的免疫治疗与5-FU介导的化疗可显著提高疗效。
此外，我们在研究中没有采用传统的腹腔注射给药的方式，而是采用瘤内注射的方法，主要是考虑到腹腔注射的CTLs遍及全身，能到达肿瘤组织的CTLs数量有限。而采用瘤内注射可以保证瘤内CTLs的数量，使其有效杀伤及抑制肿瘤，达到治疗肿瘤的目的。此外，5-FU的主要副作用是胃肠道反应和骨髓抑制，瘤内给药可以减少药物在正常组织中的分布，避免其全身的副作用，并且保证瘤内5-FU的浓度，从而使其有效抑制肿瘤生长。
本研究结果表明：联合应用以DCs为基础的肿瘤免疫治疗与由5-FU介导的化疗，其治疗效果优于单一手段治疗，不失为一种治疗肿瘤的更为有效的方法，值得进一步研究与探讨。
【参考文献】
1 葛莲英.树突状细胞与肿瘤免疫及其在肿瘤生物治疗中的应用.中国医学文摘-肿瘤学,2006,20（3）:261-263.
2 曹雪涛.树突状细胞的分化发育、抗原提呈及其功能调控的研究. 第二军医大学学报，2004,25（5）:547-549.
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4 Yeh KH，Yeh SH，Hsu CH，et al.Prolonged and enhaned suppression of thymidylate synthase by weekly 24-h intusion of high-dose 5-fluorourac.Br J Cancer,2000,83（11）:1510-1515．
5 曾晖,邹冰,谭慧珍,等.苦参碱联合5-Fu抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长作用及机制.广州中医药大学学报,2006,23（2）:164-167.
作者单位：121000 辽宁锦州，锦州市中心医院神经内科