点击显示 收起
【摘要】 纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶，与传统的一些溶栓剂相比，其具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血、纤溶活性强、作用时间长等优点。有望被开发为新一代的口服抗血栓药物。本文就纳豆激酶的结构、理化性质、活性测定方法，作用机制以及开发现状和应用前景等方面进行了综述。
【关键词】 血栓；纳豆激酶；活性测定；溶栓功能
【Abstract】 Nattokinase is a kind of serine proteinase that has strong fibrinolytic activity produced by Bacillus subtilis（natto）．As compared with some traditional thrombolytics，nattokinase possesses the advantages of safety，low cost，and effective by oral administration etc．Some advances in nattokinase research were reviewed in this paper，mainly its structure,physicochemical properties, biological function of dissolving fibrin, activity assay method and its prospect.
【Key words】 thrombosis；nattokinase；activity assay； dissolve fibrin
血栓疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，包括心血栓、脑血栓、肺栓塞和末梢动静脉血栓等常见疾病。据估计，全世界有血栓性疾病患者约1500万人，其中每年死于心脑血栓疾病的就高达1200万人。在我国，血栓性疾病造成的损失也极为严重，尤其是随着人们生活水平和生活方式改变导致膳食中高脂肪、高蛋白的过量摄取和老龄化社会的到来，血栓性疾病已超过癌症和糖尿病成为第一大健康杀手，每年约有100多万人因此死亡［1］。 目前临床上治疗血栓和栓塞主要是通过注射尿激酶（UK）、链激酶（SK）、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、乙酰化纤溶酶原链激酶激活剂（APSAC）和单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（SCUPA）。这些药物均为纤溶酶原激活剂，通过激活纤溶酶原生成纤溶酶而降解纤维蛋白。在实际应用中它们都具有一定的局限性，或是毒性比较强，易引起出血，不良反应大；或是在体内半衰期短，且不易被吸收，只能静脉给药，药效难以发挥；或是来源紧缺，成本高，价格昂贵 。 1987年，日本学者须见洋行等［2］ 首次报道在纳豆中存在一种具有强烈纤溶活性的酶—纳豆激酶（nattokinase，NK；subtilisin，NAT）。20年来,研究者们对纳豆激酶的理化特性、作用机制及生产工艺等方面进行了较为详尽的研究。实验研究证实［3］ 该酶不仅易于提取纯化，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任何毒副作用。因此，有望成为一种新型溶栓药物。
1 纳豆的生理功能与纳豆激酶的发现
纳豆（natto）在日本是一种历史悠久的大豆发酵食品，已有1000多年的历史。 早在日本江户时代，纳豆就作为一种健康食品，可用来治疗风邪、醒酒，也用来预防和治疗心脑血管疾病。纳豆的主要成分除大豆各种营养成分外，具有生理活性的物质有纳豆激酶、超氧化物歧化酶（SOD）、异黄酮、皂苷类、生育酚、吡啶二羧酸、维生素K2等。现代研究认为纳豆具有以下生理功能：防治骨质疏松；溶栓作用；抗菌、消毒；预防高血压；抗癌作用；抑制高血糖。 纳豆激酶是由日本学者须见洋行于1987年首次发现的，他从200余种食品中发现纳豆有溶解血栓的作用，并对纳豆及其提取物首次做了系统研究，纳豆发酵而产生一种具有强烈纤溶作用的酶，该酶能明显缩短优球蛋白的溶解时间。他们在研究纳豆芽孢杆菌的生理生化特征后，认为其分类地位应归在枯草杆菌中［12］。最初将酶的提取物添加到纤维蛋白平板上，有明显的溶栓作用，并确定是一种具有纤溶活性的激酶。随后很多科学家都相继做了这方面的研究，发现它具有其他溶栓药物优点的同时还有其自身优点，主要表现在半衰期长（2～8h）、抗原性弱、毒副作用小，药源广泛，在胃肠道pH值环境中仍能保持活性，既可间接激活体内的纤溶酶原溶解血栓的主要成分纤维蛋白，又可直接作用于纤维蛋白。从而使其成为一种很有潜力的新型溶栓药物。纳豆激酶在日本已得到广泛深入的研究，在我国还刚刚起步。
2 纳豆激酶的结构和理化性质
NK的最初产物是381氨基酸的蛋白前体（precursor），其中N端的1-23氨基酸残基是信号肽，24-106氨基酸残基是前导肽（propeptide）。蛋白前体切除N端的106个氨基酸残基成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶；而去掉信号肽的产物（含前导肽和成熟肽）称为纳豆激酶酶原（pro-nattokinase，pro-NK）。信号肽包含一个带3个正电荷的亲水N端以及一段不带电荷的疏水残基序列，其功能是使NK正常分泌出胞外，其切割位点位于Ala-Glu-Ala保守序列之后。信号肽与成熟肽之间具有的前导肽具有帮助NK正常折叠形成活性构象的功能，目前已发现一些与NK基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。 须见洋行等于1987年探明了纳豆激酶氨基酸序列的一级结构，纳豆激酶由275个氨基酸组成的单链多肽结构，如图1所示。NK肽链无二硫键，活性中心在Asp32、His64和Ser221，与底物结合部位在Serl25、Lenl26和Glyl27处。 图1 NK的一级结构图［4］ 氨基酸序列NK与大多数枯草杆菌蛋白酶在核苷酸序列上和肽链氨基酸组成上具有高度同源性，它与B.subtilis 1168 产生的枯草杆菌蛋白酶E仅有13个核苷酸不同，在肽链组成上仅有2个氨基酸不同，它们成熟肽链一级结构的相同性为99.5%［5］。 由于测定分子量采用的技术方法不同，所测得的分子量也明显不同。须见洋行用SephadexG-100柱凝胶过滤法得到的结果为20 000，后来他在另外的文章中发表用SDS-PAGE凝胶电泳法测得的分子量为35 000，而有人用圆二色法测定为27 300［4 ，6］ 。现由分离纯化的纳豆激酶基因DNA序列推出其氨基酸序列，根据该顺序计算出该酶的准确分子量为27 728，远小于尿激酶的分子量54 000。用Svunsson柱型电泳法等电聚焦测得纳豆激酶具有对称的单一的纤溶酶峰，其pI值为8.6±0.3。 纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，在1mmol/L二异丙基氟代磷酸酯（DFP）和5 mmol/L敌百虫（Neguron）及5 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）作用下完全失活；由于不含半胱氨酸（Cys）和二硫键，其活性不受5 mmol/L Cys影响［7］。 Sumi等［3］利用几种人工合成的小分子短肽作反应底物，研究纳豆激酶的酰胺水解活性，发现纳豆激酶具有特异的水解蛋白的氨基酸作用。
3 纳豆激酶活性测定方法［8］
3.1 纤维蛋白平板法 纤维蛋白平板法是最早用于NK活性测定的方法之一，它是参照尿激酶（UK）或组织纤溶酶原激活剂（tPA）的测活方法建立的［9］。其原理是以凝血酶作用纤维蛋白原产生由交联纤维蛋白组成的人工血栓平板，然后注入NK，根据NK分解纤维蛋白产生的透明圈面积来表示NK的溶纤维活性［10］。 测定时，先在培养皿中加入血纤维蛋白原（Fibrinogen）溶液和凝血酶溶液，搅拌使其凝固制成平板。然后取不同浓度NK样品点于平板上，37℃恒温孵育18h后测产生的透明圈直径，再计算透明圈面积。研究发现，酶活力与溶解面积成直线关系。以标准NK或UK或Plasimin为标准品作标准曲线。NK的活性单位定义为:在37℃时1 min内分解1nmol溶解于0.1mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.4）中的浓度为SX10-4mol/L的H-D-val-Leu-Lys-pNA的NK量为lu，也可以用UK或纤溶酶的活性单位来表示［11］。
3.2 纤维蛋白块溶解时间（CLT）法［10］ 此法简称CLT法。纤溶酶、tPA、UK等溶血栓物质都以此方法来测定活性。测定NK活性的方法就是根据以上各种方法稍加变动而建立的。在0℃下，依次加入凝血酶、硼酸生理盐水缓冲溶液、NK溶液和纤维蛋白原至一小试管，强烈搅拌 后，置于37℃恒温水浴。从纤维蛋白形成、反应液混浊、有气泡上升到液面时开始计时，到气泡停止冒出时止，所测时间作为纤维蛋白溶解时间（CLT）。同法以标准NK或UK或纤溶酶作为标准品，以CLT对NK浓度的对数作图为测量工作曲线，该线在10～70μg范围内有很好的线性关系。
3.3 酶联免疫吸附法（ELISA）［12］ 该法是以对纳豆激酶有特异性的单克隆抗体与纳豆激酶发生特异性结合，然后再同连有标志酶的多克隆抗体结合，形成一种类似三明治的结构，通过标志酶—过氧化物酶的反应测定纳豆激酶样品的活性。具体方法为先将抗纳豆激酶的单克隆抗体同纳豆激酶样品孵育，再同连有过氧化氢酶的多克隆抗体结合。加入新配制的底物溶液，孵育10 min，再加入1 mol/L硫酸，测定490 nm 处的吸光值。
3.4 四肽底物法［13］ 纳豆激酶与枯草杆菌蛋白酶（subitilisin）同源性极高，特别是它与枯草杆菌蛋白酶E只有两个氨基酸的差异，同源性高达99.3%。而且NK与枯草杆菌蛋白酶E的催化中心相同。因此有人用测定枯草杆菌蛋白酶E的方法来测定NK的活性，操作与枯草杆菌蛋白酶E的测活方法相同:在四肽底物suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶液中加入NK酶液，在37℃水浴中孵育1min后测定单位时间内410nm处光吸收的变化。NK的活性定义为1min，水解Suc-AAPF-pNA时生成1μl-硝基苯胺的NK量为1个单位（U）。
3.5 血清板法［13］ 血清板法是纤维平板法的改进。其原理是:纤维蛋白形成初始，在655nm处的吸光度最大，随着NK的加入，纤维蛋白溶解，吸光度会逐渐降低。试验发现，吸光度的减少同NK的浓度成线性关系。 在血清板的小孔内依照纤维蛋白平板法的制作方法，制成微型纤维平板，然后在每个孔内加入不同浓度的标准NK。反应开始4h内，每30min测定一次值，然后计算出每个时刻OD655值同初始OD655值的差-ΔOD655/h ，利用最小二乘法算出直线的斜率: -ΔOD655/h。以此斜率同NK浓度的对数作图，可得到良好的线性关系。 以上几种纳豆激酶的活性测定方法，各有优缺点。目前普遍使用的仍是经典的纤维蛋白平板法和纤维蛋白块溶解时间法。
4 纳豆激酶的溶栓性能
大多数溶栓药物，如链激酶、尿激酶、t-PA等都是纤溶酶原激活剂型。均需通过激活靶酶。即纤维蛋白溶酶原（Plasminogen）转变为纤维蛋白溶酶，再与纤维蛋白（Fibrin）结合，发挥溶栓作用，而其自身不能直接作用于纤维蛋白［14］。纳豆激酶则不然（见图2），它对纤维蛋白尤其是交联形式的纤维蛋白本身更加敏感，可直接将其水解成小肽和氨基酸［15］。当把酶提取液滴加到纤维蛋白平板上，短时间内即可出现透明的溶解圈，体外溶栓效果显著。此外，将纳豆激酶应用于狗的血栓模型实验及健康人群的体内研究［16,17］，表明其不仅可以抑制血栓的形成，还可迅速降解纤维蛋白，增加纤维蛋白降解产物（FDP）的量，明显缩短血浆中的优球蛋白的溶解时间（ELT），提高优球蛋白的纤溶活性（EFA），并能降低PAI等纤溶酶原激活因子抑制子的活性，从而激活静脉内皮细胞，引起t-PA 的继发性增加，同时激活尿激酶原（pro-UK）转变为尿激酶［17］，使内源性纤溶酶量和活性间接增强，具有双重功能。研究表明，纳豆激酶的溶栓效果远大于纤溶酶和弹性蛋白酶，活性是纤溶酶的4倍。
5 研发前景
由于使用不同的纳豆菌发酵产生的纳豆激酶的量和活性有很大差别，因而如何获得合适的菌株，并控制一定的条件，使纳豆激酶占纤溶成分中的大部分甚至全部，对大规模生产是至关重要的：首先是菌种选育，有意识地分离筛选纳豆激酶活力高的菌株，并进一步诱变，或利用基因工程技术对其进行改造；其次是改变进而优化培养条件，使菌株在最佳生长环境中生长。很多学者已就此两方面进行了大量的研究。血栓栓塞性疾病是引起死亡的主要原因之一，是现今仅次于癌症的第二大病症。目前常用的及一些还在研制开发的溶栓药物如链激酶、尿激酶、水蛭素（Hirudin）、t-PA 等均在不同程度上存在不足 ：或是毒性比较强，易引起出血，副作用大；或是在体内半衰期短，且不易被吸收，只能静脉给药，药效难以发挥；或是来源紧缺，成本高，价格昂贵，很难成为一种大众药品 。而目前的研究表明，纳豆激酶却可以很好地弥补这些缺陷，它分子量小，无免疫原性，安全无毒，药效高，作用时间长，不仅能抑制血栓形成，而且溶栓作用强，并抗胰酶水解，在肠道内稳定性好，易被人体消化吸收 ，因而既可以静脉给药，也可以口服。同时纳豆激酶除可以直接作用于交联纤维蛋白外，还可使机体自身纤溶酶系统活化，从而温和、持续地提高血液的纤溶活性。此外，纳豆激酶可以采用细菌发酵进行规模生产，周期短，产量高，且易于提取纯化，成本低廉。这些独特的优点无疑将使其成为新一代理想的预防和治疗栓塞的生化药物。
【参考文献】
1 魏华，赵祥颖，刘建军. 纳豆激酶的纤溶功能现状研究. 山东食品发酵，2006，3：27-30.
2 Sumi H， Hamada H,Tsushima H，et a1．A nove1 fibri．Nolytie enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese natto：atypical and popular soybean food in the Japanese diet．Experientia，1987，43：1110-11l1．
3 胡景柱，夏寿华，吴林. 纳豆冻干粉的安全性研究. 安徽农业科学,2000，28：380-381．
4 邓立新. 新一代溶栓药物纳豆激酶. 现代中西医结合杂志,2007，7（19）:2775-2776.
5 Nakarnura T，Youher Y，Eiji I．Nucleotide sequence of the Subtilisin NAT，aprn of bacillus subtilis（natto）．Biosci Biotech Biochem，1992，56（11）：1869-1872.
6 程守强，梁凤来，王仁静，等. 纳豆激酶的研究进展. 微生物学杂志,2005,2（25）:69-74.
7 Kamata H， Yamagata Y，Nakamura，et al.Characteri zation of the complex between aomacroglobulin and a serine proteinase from Bacillus natto．Agric Biol Chem，1989，53：2695-2702．
8 魏华，赵祥颖，刘建军. 纳豆激酶溶栓活性的测定方法. 食品与药品,2006,8（8）:59-61.
9 Astrup T，& Mullertz S．The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity．Arch Biochem Biophys，1952，40：346-351．
10 须见洋行，中岛伸佳，田谷直俊．The method of determination of the thrombolytic enzyme nattokinase．J Brew So Japan，1998，88：482-486．
11 胡升.新型溶栓酶—纳豆激酶的基础研究. 浙江大学硕士学位论文，2003，3.
12 Yoshikazu Y， Nakagawa T， Fujita M ，et a1．A sandwich enzyme-linked immunosorbent for nattokinase．Biosci Bioteeh Biochem ，1994，58：366-370．
13 Hara T， Tadokoro Y，Satoyama T．A simple，easy and routine assay offibrinolytic enzyme activity．Jpn．So：Food Sci Tech，1996，43：172-175．
14 陈丽娟,沙长青,任永春,等. 纳豆激酶溶解血栓机制. 中国生物工程杂志，2003,4（23）:53-61.
15 Kumada KT Onga， Hoshino H，et al．The effect ofnatto possessing a high fibrinolytic activity in human plasma．Igakutu Seibutaugaku，1994，128：117-119．
16 Fujita M， Hong K， Ito Y,et al．Thrombolytie effect of nattokinase on a chemically indueed thrombosis model in rat．Bio1 Pharm Bul，1995，18：1387-1391．
17 Sumi H ，Hamada H，Nakanishi K，et a1．Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase．Acta Haematol，1990，84：139-143．
作者单位：北京，北京大学生命科学学院（△通讯作者）