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【摘要】 目的 一种琥乙红霉素片微生物限度检查方法的验证。方法 采用薄膜过滤法检验,《中国药典》2005年版收载的方法进行验证。结果 菌株的回收率均高于70%,控制菌检查具有专属性。结论 采用薄膜过滤法检查琥乙红霉素片微生物限度有可行。
【关键词】 琥乙红霉素片 微生物限度检查 薄膜过滤法
琥乙红霉素有杀菌作用,对微生物生长有干扰,按常规方法测定其微生物限度无法确保结果的准确性,方法学验证是保证结果准确的惟一途径。
1 仪器与材料
1.1 仪器 开放式薄膜过滤器（孔径0.45μm,滤膜直径50mm）,恒温培养箱、培养皿,抽滤泵。
1.2 样品 琥乙红霉素片。
1.3 培养基 营养琼脂培养基,玫瑰红钠琼脂培养基,胆盐乳糖增菌液,4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基,均为干燥培养基，临用前按说明书称量配制灭菌。
1.4 稀释液及冲洗液 pH7.0的灭菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
1.5 菌种 大肠埃希菌,枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,白色念珠菌,均购自云南省药品检验所。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 供试液制备 称取样品10g,研细,加稀释液至100ml，制成1：10供试液。
2.1.2 菌液制备 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌菌液均按《中国药典》2005年版二部方法制备,浓度为50～100cfu/ml［1］。
2.1.3 细菌总数、霉菌及酵母菌总数检查方法的验证
2.1.3.1 试验组 取供试液1ml,加入50ml的稀释液中，混匀，经薄膜过滤后,冲洗3次,每次100ml，在最后一次的冲洗液中加入1ml菌液,冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养,平行制备2个平皿。按《中国药典》2005年版菌落计数方法计数［1］。
2.1.3.2 菌液组 测定所加的试验菌数。除不加供试液外,操作同试验组。
2.1.3.3 供试品对照组 测定供试品本底菌数。除不加菌液外,操作同试验组。
2.1.3.4 稀释液对照组 测定稀释液是否干扰微生物生长。取稀释液1ml,其余同试验组。
2.1.4 控制菌检查方法的验证
2.1.4.1 试验组 取供试液的上清液10ml,加入100ml稀释液中，混匀，经薄膜过滤后，冲洗3次,每次100ml，在最后一次的冲洗液中加入大肠埃希菌菌液1ml,抽滤,取出滤膜加入到100ml胆盐乳糖增菌液中,37℃恒温培养 l8～24h后做 MUG试验及靛基质试验。
2.1.4.2 阴性菌对照组 方法同试验组,加入金黄色葡萄球菌菌液1ml代替大肠埃希菌。同时做稀释液和培养基阴性对照。
2.2 结果
2.2.1 细菌总数、霉菌及酵母菌总数检查方法验证 4种菌株的回收率均高于70%,符合验证规定。稀释剂对照组的回收率（%）=（稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数）×100%;试验组的回收率（%） =［（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数］×100%。
2.2.2 控制菌检查方法验证 试验组阳性菌对照检出大肠埃希菌,阴性菌对照未检出大肠埃希菌,说明本法可检出大肠埃希菌,具有专属性,符合验证规定。
3 讨论
薄膜过滤使微生物充分被滤膜截留,再用适量无干扰的冲洗液洗去供试样品的干扰,就能准确地进行样品的微生物限度检查。冲洗液的用量是关键,如过量冲洗,会使菌体受损、不利于生长,从而影响回收率,还会使滤膜受损、孔径改变,影响实验结果。反之,如冲洗不充分,样品抗菌作用就不能彻底消除,也无法保证实验结果的准确性。
【参考文献】
1 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典，二部.北京：化学工业出版社,2005，附录XIJ.
作者单位：657000 云南昭通，昭通市食品药品检验所