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【摘要】 目的 研究胰岛素样生长因子Ⅰ型受体（insulin-1ike growth factors-ⅠR，IGF-ⅠR）反义基因对SMMC-7721肝癌细胞恶性表型的影响。方法 构建IGF-ⅠR反义基因真核表达载体，观测IGF-ⅠR反义基因对肝癌细胞恶性表型的影响。结果 IGF-ⅠR反义基因能明显下调内源性IGF-ⅠR的表达，与7721细胞、IGF-ⅠR正义细胞差异有显著性（P<0.01）。反义细胞G0／G1期明显增加（63.9%），S期减少（19.3%），细胞凋亡增加（5.89%），与7721细胞、正义细胞差异有显著性（P<0.01）。反义细胞不能在软琼脂中生长，7721细胞及正义细胞则生长良好。结论 IGF-ⅠR反义基因显著下调了内源性IGF-ⅠR的表达，对SMMC-7721肝癌细胞恶性表型有明显抑制作用。
【关键词】 胰岛素样生长因子Ⅰ型受体 反义基因 凋亡 肝细胞癌
Effect of down-regulation of IGF-ⅠR on human hepatocellular carcinoma cells
ZHANG Qi-jie, ZHOU Ping.Department of Gastroenterology, Central Hospital of Zibo City, Shandong 255036，China
【Abstract】 Objective To study the effect of antisense gene to I type of insulin like growth factor （IGF-ⅠR） on malignant phenotype of SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma.Methods Recombinant vectors of sense and antisense gene to IGF-ⅠR were constructed and transfected into SMMC-7721 cell line by liposome method in order to study the effect of antisense gene to IGF-ⅠR on malignant phenotype of SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma.Results The level of endogenous expression of IGF-ⅠR was down-regulated by IGF-ⅠR antisense gene transfection and its level was significant lower than 7721 and sense cells （P<0.01）. In the antisense cells the proportion of G1 phase cells （63.9%） and apoptotic cells （5.89%） increased, but the proportion of S phase cells （19.3%） decreased in the antisense cells, with significant difference between antisense cells and sense and parent cells （P<0.01）. The antisense cells could not grow in soft agar, but sense and parent cells could grow. Conclusion The level of endogenous expression of IGF-ⅠR in SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma was down-regulated by IGF-ⅠR antisense gene and the malignant phenotype of SMMC-7721 cell line of human hepatocellular carcinoma is significantly inhibitted.
【Key words】 IGF-ⅠR； antisense gene; apoptosis; hepatocellular carcinoma
胰岛素样生长因子通过IGF-ⅠR介导在细胞增殖、转化及肿瘤发生、发展中发挥重要的促进作用［1,2］。本研究通过IGF-ⅠR反义基因阻断SMMC-7721肝癌细胞株IGF-ⅠR表达，观察SMMC-7721肝癌细胞株恶性表型的变化，以期为肿瘤防治提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料 SP免疫组化试剂盒、IGF-ⅠR多克隆抗体（北京中山公司），质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、脂质体转染试剂盒、限制性内切酶、连接酶（Promega公司），载体pBluescript SK（stratagene公司）、pCMVhygro（上海市肿瘤研究所），宿主菌XL1-Blue （stratagene公司），潮霉素（Boehringer MaDHheim公司），MTT （华美公司），其余均为国产优质分析纯试剂。SMMC-7721入肝癌细胞株（中科院上海细胞所）。主要实验仪器：酶联免疫检测仪，紫外分光分析仪，流式细胞仪FACSTplusBD，扫描电镜 AMRAYl000B，透射电镜 GEM 2000EX，图像分析仪 MD20型。
1.2 实验方法
1.2．1 质粒DNA的提取及纯化 按质粒提取试剂盒操作说明书操作。
1.2．2 质粒cDNA片段的回收纯化 按DNA纯化试剂盒说明书操作。
1.2．3 IGF-ⅠR正、反义真核表达重组体的构建 提取载体质粒pCMVhygro的方法同前，以Bam HI酶切，去磷酸化处理的载体质粒pCMVhygro和IGF-ⅠR cDNA插入子，按载体：插入子1：2的比例加入到连接反应体系中，氯化钙法转化大肠杆菌XLl-Blue感受态细胞。接种扩增有插入的单菌落，提取质粒，酶切鉴定重组体。
1.2．4 细胞培养 SMMC-7721肝癌细胞在DMEM培养液中于37℃、5％CO2、饱和湿度下培养，培养基中含10％的小牛血清，青霉素100u／ml，链霉素100u／ml。
1.2．5 潮霉素毒性实验 在96孔培养板中，每孔加入200μl含200个细胞的细胞悬液，次日换成每毫升含潮霉素50、100、150、200、300、400、500μg的培养液。培养 7～10天，观察细胞克隆形成情况，确定潮霉素的筛选浓度。
1.2．6 转染实验 按脂质体转染试剂盒操作说明。
1.2．7 IGF-ⅠR cDNA蛋白表达水平的测定 应用SP免疫组化及图像分析。
1.2．8 形态学检查
1.2.8.1 光学显微镜检查 常规HE染色。
1.2.8.2 扫描电镜 细胞铺片3％戊二醛固定，0.1M PBS漂洗，酒精递度脱水，醋酸异戊酯置换，临界点干燥，镀膜，上镜观察。
1.2.8.3 透射电镜 胰酶消化细胞，细胞沉淀用3％戊二醛固定。0．1M PBS漂洗2次，饿酸后固定，丙酮递度脱水，浸透，包埋，切片，双铅染色，上镜观察。
1.2．9 流式细胞仪检测细胞周期、凋亡
1.2．10 软琼脂克隆形成实验 37℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养14天，计数含50个细胞以上的克隆。
1.2．11 统计学分析 计量资料采用双因素、单因素方差分析，计数资料采用二维列联表分析，P<0．05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 IGF-ⅠR正、反义真核表达重组体的构建 IGF-ⅠR目的片段与脱磷的载体pCMVhygro通过T4 DNA连接酶连接。抽提质粒后经XbaI、XhoI双酶切证实正义重组体为9.12kb、1.698kb二段，反义重组体为5.468kb、5.35kb二段。表明已成功构建了IGF-ⅠR-pCMVhygro的正、反义重组体。
2.2 潮霉素筛选浓度的确定 培养第7～10天镜下观察，潮霉素100μg／ml的筛选浓度可有效杀死未转染的细胞。
2.3 转染IGF-ⅠR正、反义真核表达重组体的细胞免疫组化及图像分析，结果显示SMMC-7721肝癌细胞IGF-ⅠR呈高表达，光密度值为252.5±71.6（n＝166），IGF-ⅠR正义细胞光密度值为240.5±83.6（n＝170），二者差异无显著性（P>0.05），IGF-ⅠR反义细胞光密度值为127.7±46，与SMMC-7721细胞、IGF-ⅠR正义细胞比较差异有非常显著性（P<0.01，见图1～3）。提示IGF-ⅠR反义基因显著降低了IGF-ⅠR蛋白在SMMC-7721细胞中的表达。
2.4 细胞形态学改变 光学显微镜：细胞呈多角形或卵圆形，核型不规则，深染。可见核分裂象及多个核仁，反义细胞与正义细胞、SMMC-7721细胞无明显变化。扫描电镜：SMMC-7721细胞：呈多角形、椭圆形，有微绒毛，正义细胞异形性明显，呈多角形、椭圆形及梭形，微绒毛较长，反义细胞以椭圆形为主，微绒毛减少、变短。透射电镜：SMMC-7721细胞大小不等，核增大，核形不规则，核浆比例增大，游离核糖体、线粒体增多，核仁增多、增大，可见微腺腔。IGF-ⅠR正义细胞可见瘤巨细胞及明显病理性核分裂象。IGF-ⅠR反义细胞胞浆内可见微腺腔、灶性坏死、髓鞘样结构，部分细胞核浓缩、深染，细胞器破坏，并可见细胞碎片，胞浆内可见多发性低电子密度区，不规则，内似有中等电子密度丝状物质。
2.5 细胞周期及细胞凋亡 流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡（见表1），显示IGF-ⅠR反义细胞G1期细胞明显增加，S期细胞减少，而且凋亡增加， 与7211细胞比较差异有非常显著性（P<0.01）。IGF-ⅠR正义细胞S期细胞增加，而凋亡减少。提示IGF-ⅠR反义基因可抑制细胞增殖，促进凋亡。
2.6 软琼脂克隆形成 在双层软琼脂培养中，7天后SMMC-7721细胞与IGF-ⅠR正义基因细胞均生长良好，形成明显簇状细胞集落，而且细胞集落大，数量多，多数集落大于50个细胞。二者细胞克隆形成差异无显著性（P>0.05，见图4、5，表2）。IGF-ⅠR反义基因细胞5～7天后仅见数个克隆，而且每个克隆少于50个细胞，10天后细胞散落而死亡。说明IGF-ⅠR反义基因转染后SMMC-7721肝癌细胞锚着生长能力丧失。表1 细胞周期及凋亡注：与SMMC-7721、ⅠR -S相比*P<0.01；与SMMC-7721细胞相比**P<0.01表2 IGF-ⅠR反义基因对SMMC-7721细胞软琼脂克隆形成的影响注：与SMMC-7721细胞相比P>0.05
3 讨论
IGFs是体内重要的生长因子,它以自分泌、旁分泌等方式对组织细胞的增殖、分化、凋亡,机体的生长发育及肿瘤的发生发展起重要的调节作用。IGFs通过IGF受体介导发挥生物学作用。IGF受体有4种:IGF Ⅰ受体、IGF Ⅱ受体、IGF Ⅰ/胰岛素（IGF Ⅰ/Ins）杂合受体及胰岛素受体。IGF Ⅰ受体与胰岛素受体同属酪氨酸激酶受体家族,均是由4个亚基组成的跨膜糖蛋白,两个α亚基在细胞外与配体结合,两个β亚基跨膜且具有酪氨酸激酶活性,参与受体大部分生物学效应。当受体和配体结合后,受体β亚基胞内区的酪氨酸激酶活性被激活,催化受体蛋白自身及胞内受体底物的酪氨酸残基磷酸化,因而启动了磷酸化的级联反应。IGF Ⅰ受体有2条主要的信号转导通路:丝裂原活性蛋白激酶（Ras/MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K/Akt）通路。前者主要与其基因转录调控有关,后者与代谢效应有关［1,2］。研究表明,IGF Ⅰ能促进成纤维细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、乳腺上皮细胞、胰岛β细胞等多种细胞增殖，IGFⅠ的功能通过IGF受体介导,因此,控制IGF受体的信号转导可能为各种代谢疾病及恶性肿瘤提供有效的治疗手段。IGF-ⅠR具有显著促进细胞的有丝分裂、细胞转化及抗凋亡作用，IGF家族的三个配体均可与IGF-ⅠR结合发挥促细胞增殖作用，因此，IGF-ⅠR是肿瘤治疗较好的靶位。本研究通过构建以pCMVhygro为真核表达载体的IGF-ⅠR反义表达系统，将其转入肝癌细胞株SMMC-772I，免疫组化及图像分析显示IGF-ⅠR反义细胞IGF-ⅠR的蛋白表达明显降低，与772I细胞、IGF-ⅠR正义细胞间差异有非常显著性（P＜0.01），提示IGF-ⅠR反义基因显著下调了肝癌细胞内源性IGF-ⅠR的蛋白表达。反义细胞细胞形态学改变以椭圆形为主，且微绒毛突起减少、变短，并可见明显细胞退行性改变、灶性坏死，部分细胞核浓缩、坏死，这些改变可能与IGF-ⅠR反义基因促进细胞凋亡有关。流式细胞仪检测结果表明，7721细胞、正义细胞S期细胞明显增多。而反义细胞S期细胞减少，G0／G1期增加，与7721细胞、正义细胞差异有非常显著性（P<0.01）。结果表明IGF-ⅠR有显著的促进细胞增殖、分裂的能力，当封闭IGF-ⅠR的表达则可阻抑细胞分裂，使其停滞于G1期而不能进入S期，进而诱导细胞凋亡的发生。肿瘤细胞具有不依赖于锚着生长的恶性表型，过度表达IGF-ⅠR可使多种细胞发生转化，能够在软琼脂中增殖形成克隆及在裸鼠体内形成肿瘤,通过抑制IGF-ⅠR 表达可抑制肿瘤的增殖及转移［3,4］。肝癌细胞株SMMC-7721及IGF-ⅠR正义细胞均能增殖形成克隆，呈簇状，集落较大，部分集落可发生融合，形成克隆数分别为97.8、112.7。而反义细胞不能在软琼脂中生长，说明其不依赖于锚着生长的恶性表型丧失。笔者的研究与国外报道一致［3～5］，因此IGF ⅠR可作为肿瘤治疗的良好靶点［5～7］，通过IGF-ⅠR反义基因阻抑IGF-ⅠR过度表达可对肝癌细胞生长有显著的抑制作用。（本文图片见封三）
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作者单位：256304 山东淄博，淄博市中心医院消化内镜科北京，空军总医院消化内科