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【摘要】 目的 探讨家猪主要组织相容性复合体II类蛋白（SLA-DQ）在高容量血液滤过（HVHF）防治多器官功能障碍综合征（MODS）中的表达及意义。方法 建立二次打击猪MODS模型。将28头雄性家猪分为正常对照组（C组，n=9）、实验组（M组，n=9）和治疗组（HF组，n=10），正常对照组给予麻醉和建立动静脉通道；实验组给予二次打击建立猪MODS模型；治疗组在复制模型后进行高容量血液滤过。7天后处死动物，取脾组织以免疫组化法测脾组织SLA-DQ蛋白表达情况。结果 实验组动物死亡率为77.8％（7/9），有8例发生MODS，发生率为88.9%（8/9）。SLA-DQ蛋白的表达强度在正常对照组、滤过组、实验组中依次降低（P<0.05）。高容量血液滤过后，SLA-DQ蛋白表达升高。结论 高容量血液滤过对防治多器官功能障碍有较好效果。经HVHF治疗后，SLA-DQ蛋白表达上调。HVHF通过调节免疫平衡对MODS起到一定的防治作用。
【关键词】 SLA-DQ蛋白；高容量血液滤过；多器官功能障碍综合征；动物模型
Expression and significance of SLA-DQ protein in prevention and treatment for multiple organ dysfunction syndromes with high volume hemofiltration
DONG Bing-Dan, HE Man, WANG Bin-Sheng, et al.The People's Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000，China
【Abstract】 Objective To investigate the expression and significance of major histocompatibility complex II protein （SLA-DQ） in prevention and treatment for multiple organ dysfunction syndromes （MODS） with high volume hemofiltration （HVHF）. Methods We duplicated the two-hit porcine model of MODS. Eighteen male pigs were randomly assigned into experimental group （group M, n=9）, control group （group C, n=9） and therapeutic group （group HF, n=10）. Group M was given compound factors including hemorrhagic shock, reperfusion injury and endotoxemia, and Group C only underwent anesthesia and arterious/venous cannula. When the MODS model was established, Group HF accepted the treatment of high volume hemofiltration. After seven days the living animals were killed and splenic tissue were used to detect the level of SLA-DQ protein by immunohistochemistry.Results The mortality of group M was 77.8％ （7/9）, and the incidence rate of MODS was 88.9% （8/9）. The expressing intensity of SLA-DQ protein was significantly low by turns in Group C, Group HF and Group M （P<0.05）.Conclusion It is effective about the therapeutic results for MODS with HVHF. Up-regulation of SLA-DQA protein may due to the function of HVHF. HVHF regulates the immunologic balance and workes in the prevention and treatment for MODS.
【Key words】 SLA-DQ protein; high volume hemofiltration; multiple organ dysfunction syndrome; animal model
多器官功能障碍综合征（MODS）的一个重要环节是炎症细胞被过度激活导致免疫失衡。高容量血液滤过（HVHF） 可以非特异性地清除各种有
害介质，是一项有效的肾脏替代治疗措施。主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）的表达在淋巴细胞抗原递呈和免疫应答启动过程中有着至关重要的作用。目前对于HVHF防治MODS的免疫机制并不清楚，本文从家猪MHC II类分子（SLA-DQ）的表达来探讨HVHF的治疗机制。
1 材料
1.1 动物分组 健康雄性家猪28只（第二军医大学动物中心提供，清洁动物），体重25.22±3.17kg（22～30kg）。实验动物随机分为3组：实验组（M）9例，正常对照组（C）9例，治疗组（HF）10例。
1.2 主要材料和仪器 M1106C多功能监护仪（美国HP公司），Swan Ganz漂浮导管（美国ARROW公司），F50聚砜膜血液过滤器（德国Fresenius公司），F50聚砜膜血液过滤专用管道（德国Braun公司），EVITAW型呼吸机（德国Drager公司），鼠抗猪MHC class II DQ（英国Serotec公司），羊抗鼠IgG（英国Serotec公司）。
2 方法
2.1 模型建立 建立二次打击MODS动物模型。过程详见文献〖1 〗。
2.2 MODS诊断标准 本研究参照Hu Sen等〖2〗的动物MODS诊断标准。
2.3 高容量血液滤过 HF组在内毒素注射完毕后1h，即给予高容量血液滤过治疗，经右侧股静脉插管留置的单针双腔导管建立体外循环，血流量200ml/min，血液引出后流经F50滤器（膜面积1.4m2，滤过孔径为30kD），超滤量根据全天治疗量和生理需要量设定。血路管道预先用5000U/L的肝素生理盐水循环30min，肝素1500IU/h持续抗凝，有出血倾向时停止使用。置换液均以前稀释方式输入，采用乳酸盐置换液，流量为900～1000ml/h。每60min以400ml生理盐水冲洗血路和滤器。治疗持续时间为12h，12h后更换滤器，共3天。
2.4 器官功能监护和支持 循环、呼吸、代谢等常规支持。进行持续性心脏和呼吸功能监护，当心血管功能不全时，开始静脉滴注多巴胺维持血压；呼吸频率>40次/min或吸空气PaO2≤60mmHg时，施行简易呼吸机机械通气。每天给予静脉滴注乳酸林格液和葡萄糖液100～150ml/（kg·d）。术中、术后静脉给予氯胺酮5mg/（kg·h）、安定0.2mg/（kg·h）维持持续微泵给药，维持动物麻醉状态。
2.5 标本采集 动物观察7天，届时处死动物，器官标本行病理形态学检查。切取脾脏组织约0.5cm×1.0cm大小以10％福尔马林固定后保存。
2.6 免疫组化法测定SLA-DQ蛋白的表达 免疫组化染色按试剂盒说明进行。工作浓度l:100，以PBS缓冲液替代一抗作为对照。染色结果以出现棕黄色颗粒为表达阳性。参照文献〖3〗，以同一切片阳性细胞>30％为阳性病例，阳性细胞30％～50％为（+），50％～80％为（++），>80％为（+++）。
2.7 统计学分析 应用SPSS 10.0软件包，计数资料用χ2检验，P<0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 动物生存率和死亡率 HF组MODS发生率为20%，显著低于M组的88.9％（P<0.01）。HF组动物死亡率为20％（2/10），对照组动物死亡率为77.8％（7/9），大部分于49～144h以内死亡。HF组动物死亡率较对照组差异有显著性（P<0.05）。
3.2 SLA-DQ蛋白表达情况 猪脾组织SLA-DQ表达情况，脾脏中SLA-DQ蛋白阳性反应产物呈棕黄色，阳性细胞主要为巨噬细胞、淋巴细胞、单核细胞。正常对照组呈强阳性免疫反应，阳性反应产物多分布在胞膜上，胞浆中少见阳性免疫反应物质。M组与正常对照组比较，SLA-DQ蛋白呈弱阳性免疫反应（P<0.05），HF组与M组比较，在胞膜中阳性反应较高（P<0.05）。见图1～3。
4 讨论
4.1 HVHF治疗MODS的理论基础 MODS是由轻到重、从代偿到失代偿的一个动态发展过程，其治疗是临床医学面临的难题〖4,5〗。已有研究〖6,7〗显示，使用单克隆抗体不能阻断特殊的炎性介质如TNFα、IL-1、内毒素等，也没有显示出明确的临床价值。这是由于多种应激激素、细胞介质之间的相互作用机制非常复杂，阻断单一的介质对于“瀑布样”的全身损害难以奏效。如果能从体外清除多余的炎症介质、细胞因子和循环中的内毒素，可能对病情的转归有利，因此有学者提出以连续性血液净化理论来治疗MODS。
4.2 HVHF对MODS防治的效果 本实验在内毒素注射完毕后1h开始治疗，治疗组动物存活率为80%，明显高于对照组的22.2%。在Ronco等〖8〗的研究中也发现，早期连续性肾脏替代治疗（CRRT）有利于改善患者的预后，与纠正内环境紊乱、维持内稳态、预防更严重的并发症发生有关。沈清等〖9〗的研究证实血滤能下调SAP合并MODS的患者的炎症反应，降低促抗炎细胞因子比值，逆转促抗炎反应失衡，能有效地缓解临床症状，提高存活率。1977年Kramer等首次提出连续性动静脉血液滤过（CAVH）并应用于临床，直到目前连续性肾脏替代治疗（CRRT）已逐渐成为标准的治疗模式。高容量血液滤过（HVHF）是在CRRT的基础上发展起来的，通过增加置换液输入量进一步提高对大中分子即溶质的对流清除。HVHF时单位时间血流量增加，通过滤器的炎症介质也随之增多，同时由于跨膜压增加，促进了炎症介质与膜的接触，进一步增加了膜的吸附，因此HVHF时对流与吸附作用均有所增强。1992 年Grootendorst等〖10〗最早进行了HVHF 的实验研究，证实增加超滤量可改善接受内毒素注射猪的血流动力学。近年的大量动物和临床研究均显示〖11,12〗，与传统的连续性静脉-静脉血液滤过相比较，在感染性休克及MODS的治疗中， HVHF更能明显的改善血流动力学状态、减少正性肌力药物的用量，并能够清除部分可溶性炎症介质，下调炎症反应。笔者的研究与此类似，早期应用HVHF对MODS有较好的防治效果。
4.3 SLA-DQ蛋白在HVHF防治MODS中的表达及意义 在MODS中，机体处于免疫失衡的状态。对于内毒素等有害物质必须通过抗原呈递作用使免疫细胞识别并进行处理。MHC II类分子处于抗原呈递的中心地位，是迄今所知最复杂的遗传多态性系统。II类分子表达在CD+4T细胞的抗原呈递细胞上，如巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和B细胞。正常情况下，在受外源性抗原刺激时，单核细胞等抗原呈递细胞表达MHC II类抗原，从而可以引起CD+4 T 细胞活化，启动和增强免疫应答〖13,14〗。SLA-DQ是猪的MHC II类分子。在本文的研究中发现： SLA-DQ蛋白在MODS组的脾脏中表达量最少，HVHF次之，在正常组中表达量最多（P<0.05）。以上结果表明，在MODS时，SLA-DQ的表达下调，免疫应答受抑，加速或是加快了MODS的进程；经过HVHF后，上调了SLA-DQ的表达，机体的免疫功能有所恢复，临床转归向好转的趋势发展。在笔者先前的研究中还发现，SLA-DQ基因在MODS中的表达也是下调的〖1〗。总之，MODS的发生和发展并不是一个孤立的事件，其中有多种炎性介质和抗炎介质的参与。HVHF能有效改血流动力学，减少升压药物的用量，改善各主要脏器功能，降低MODS的发生率和死亡率。SLA-DQ蛋白的表达水平代表了机体免疫功能的变化，HVHF通过调节免疫平衡对MODS起到一定的防治作用。对于SLA-DQ基因在HVHF治疗MODS后的表达及调控机制我们将做进一步的研究。
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（编辑：汪 洋）
作者单位：1 730000 甘肃兰州，甘肃省人民医院麻醉科 2 730000 甘肃兰州，兰州大学第一医院普外科（△通讯作者）