地佐辛注射液细菌内毒素检查方法学验证

【摘要】  目的 对地佐辛注射液细菌内毒素的检查方法进行干扰试验验证。方法 采用《中国药典》2005年版二部附录XIE的凝胶法。结果 地佐辛注射液稀释至浓度为0.025mg/ml时对试验无干扰作用。结论 该方法有效可行，可用于该品种的细菌内毒素检查。

【关键词】  地佐辛注射液;细菌内毒素;凝胶法;干扰试验验证

　地佐辛(dezocine)是一种强效阿片类镇痛药，能缓解术后疼痛，其镇痛强度、起效时间和作用持续时间与吗啡相同，成瘾性小，皮下、肌肉注射吸收迅速，肌注30min内生效，静注15min内生效。为探讨地佐辛注射液细菌内毒素检查方法的可行性，笔者采用凝胶法进行了一系列试验，现将结果报告如下。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　ZH-2型自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂);DC-3A型干式恒温器(南京三爱斯技术开发有限公司); LC-233B1鼓风干燥箱(上海爱斯佩克环境设备有限公司)。

　　1.2 试药

　　细菌内毒素检查用水(BET水)[批号：0912020，规格：50ml/瓶，来源：湛江安度斯生物有限公司]、细菌内毒素工作标准品(CSE)[批号：150601-200964，效价：160Eu/支，来源：中国药品生物制品检定所]、鲎试剂(TAL)〔批号：0911021(λ=0.125Eu/ml，干扰预试验用)、0911062(λ=0.25Eu/ml，正式干扰试验用)，规格：0.1ml/支，来源：湛江安度斯生物有限公司〕、地佐辛注射液〔批号：09092701、09092801、09092901，规格：1ml：5mg，来源：扬子江药业集团有限公司〕。整个试验过程应防止微生物污染，所用器械应经处理，保证无外源性物质干扰[1]。

　　2 方法[1～3]与结果

　　2.1 鲎试剂灵敏度复核试验

　　用BET水将CSE稀释成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ 4个浓度的内毒素标准溶液，每一浓度稀释液平行做4管，依法进行试验。结果表明上述两个批号的TAL的复核灵敏度与标示灵敏度相符，均在0.5～2.0λ范围内，可用于试验。

　　2.2 供试品干扰试验预试验[4]

　　本品标准中规定限值L为“每1mg细菌内毒素应不得过10Eu”，其规格为5mg/ml，即原液浓度为50Eu/ml。 由于目前市售鲎试剂的灵敏度为0.5～0.03Eu/ml之间，则供试品的最大有效稀释倍数(MVD)= CL/λ =100～1666之间，对应于灵敏度(λ)为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03Eu/ml，采用不超过最大有效稀释倍数即原液稀释为100、200、400、833、1666倍的溶液(供试品浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 Eu/ml)作为供试品溶液;另制备同样系列浓度的供试液，并使每一供试液均含有2λ(0.25 Eu/ml)浓度的内毒素溶液作为供试品阳性溶液。取λ为0.125Eu/ml的鲎试剂，分别与上述两个系列溶液反应，每个浓度平行2管。同时分别取2支鲎试剂加入BET水作为阴性对照，取2支加入2λ(0.25Eu/ml)内毒素溶液作为阳性对照。结果见表1。表1 干扰试验预试验结果

　　2.3 供试品干扰实验

　　取灵敏度(λ)为0.25Eu/ml的鲎试剂进行正式干扰试验，则供试品最大有效稀释倍数(MVD)= CL/λ =200倍。用BET水将地佐辛注射液稀释至0.5Eu/ml、0.25Eu/ml的两个不同浓度溶液作为供试品溶液。另取一支细菌内毒素标准品，加入1.0ml BET水使溶解，用封口膜将瓶颈封严，置漩涡混合器上混合15min，然后用BET水依次稀释至1.0、0.5、0.25、0.125、0.06(Eu/ml)的不同浓度溶液，其中0.5、0.25、0.125、0.06(Eu/ml)的浓度溶液作为Es系列溶液。再取1.0、0.5、0.25、0.125(Eu/ml)的Es系列溶液分别与0.5Eu/ml的供试品溶液1：1混合，作为Et系列溶液。取鲎试剂36支，分别用0.1ml的BET水复溶后，加入上述Es、Et系列溶液各0.1ml，每个浓度平行4管，同时取2支鲎试剂加入BET水作为阴性对照，取2支加入0.25 Eu/ml的供试品溶液作为供试品阴性对照，置(37±1)℃保温(60±2)min后观察，结果见表2。表2 干扰试验结果

　　2.4 供试品细菌内毒素检查

　　取本品，按照《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法，选用灵敏度(λ)为0.25 Eu/ml的鲎试剂依法检查，结果见表3。说明地佐辛注射液的细菌内毒素检查结果均小于10Eu/mg。表3 干扰试验结果

　　3 讨论

　　凝胶法是根据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机制，通过采用翻转180°的目测方法来判断终点。此方法操作简单、经济、快速。供试品预干扰试验的目的是通过对一系列含2λ细菌内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂反应，初步筛选出对鲎试验无干扰的样品浓度范围，可大大降低试剂的消耗，节省时间，减少干扰试验的盲目性。表1结果说明，样品的浓度在稀释100～1666倍时，对细菌内毒素检查法均无干扰作用。表2、表3结果说明，当供试品的浓度稀释至200倍时，采用灵敏度(λ)为0.25Eu/ml的鲎试剂对地佐辛注射液(1ml：5mg)的细菌内毒素进行检查，该方法可行。

【参考文献】
  　1 国家药典委员会.中国药典，2005年版，二部.北京：化学工业出版社，2005，附录ⅪE85.

　　2 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范.北京：中国医药科技出版社，2005,267-269.

　　3 熊向党，冯聚锦，韦群.细菌内毒素检测技术与应用.湛江安度斯生物有限公司，2007,6(1):13-19.

　　4 戴艳，吉同琴，陈祥峰.注射用兰索拉唑细菌内毒素检查法.中国药师，2009，12(1)：122-123.