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【摘要】 目的 通过对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中心体表达和细胞分裂形态的研究，探讨中心体通过对细胞分裂过程的调控，在促进HNSCC染色体不断变化、发展过程中的作用。 方法 8个HNSCC细胞系和6例头颈部正常组织上皮细胞培养。收获细胞经苏木素和伊红染色，观察分裂中期细胞核形态，计算核多极分裂象细胞百分比。应用抗γ-微管蛋白抗体免疫荧光染色检测细胞中心体，计算含异常中心体数目细胞的百分比。两组数据行直线相关分析。HNSCC组和对照组两组数据平均值行t检验。 结果 HNSCC细胞系多极核分裂象细胞平均占分裂中期细胞的（9.9±4.8）%，含中心体扩增的细胞平均占总体细胞的（6.7±3.1）%，且二者呈显著正相关，r=0.857，P<0.01。而正常对照组细胞仅偶尔出现异常分裂中期形态及异常的中心体数目，其平均值分别为（0.8±0.9）%和（1.2±1.4）%。HNSCC组和对照组两组数据平均值行t检验，HN-SCC组显著高于对照组，t值分别为4.50和4.01，P<0.01。 结论 中心体的异常扩增及其导致的细胞多极分裂是HNSCC病程中的重要体现，在促进HNSCC染色体畸变及其基因变异过程中起重要作用。
关键词 头颈部鳞状细胞癌 染色体 有丝分裂 中心体
Centrosome expression and metaphase morphology in head and neck squamous cell carcinomas
Lv Mei，Liu Zuoqing，Dong Zhen，et al.
Department of Otolaryngology，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011.
【Abstract】 Objective To study the underlying mutational mechanisms of chromosomal evolution in head and neck squamous cell carcinomas，centrosome expression and metaphase morphology were investigated in8HNSCC cell lines.Methods Cell cultures were harvested and stained with haematoxylin and eosin，to analyze cellular metaphase morphology.Centrosomes were detected by anti-γtubulin antibodies using the technique of immunofluorescence hy-bridization.Epithelial cell cultures from6normal head and neck tissues were used as normal controls in the trials.Re-sults Metaphase multipolar mitoses and centrosome amplification were found in all HNSCC cell lines at the average fre-quencies of（9.9±4.8）%and（6.7±3.1）%separately.Also there was a significant positive correlation between them，r=0.857，P<0.01.However，the normal controls seldom showed metaphase multipolar mitoses and centrosome amplification，with the average frequencies of（0.8±0.9）%and（1.2±1.4）%separately.The frequencies of HNSCC cell lines were greatly higher than those of normal controls，P<0.01.Conclusion Super-amplified centrosomes caused multipolar cell division and contribute to gross chromosomal aberrations of HNSCC.
Key words head and neck squamous cell carcinoma chromosome mitoses centrosome
大多数头颈部恶性肿瘤表现为复杂的染色体和基因组改变，并随着肿瘤的发生、发展而不断的向更复杂的方向演变。研究表明，细胞的异常分裂如多极分裂可导致子细胞染色体数量上的异常。中心体作为细胞分裂中期纺锤体的极点，在组织子细胞染色体分配过程中起决定性作用［1］ 。本实验通过对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系中心体表达和细胞分裂形态的检测和分析，探讨中心体通过对细胞分裂过程的调控，在促进HNSCC染色体不断变化、发展过程中的作用。
1 对象与方法
1.1 研究对象 8个HNSCC细胞系，来源部位:喉部3例，鼻窦部2例，口腔2例，鼻咽部1例（香港大学解剖教研室Sai-Wah Tsao教授赠给）。6例正常对照组织:2例下鼻甲黏膜上皮（来自耳鼻喉科鼻整形患者），2例鼻咽部黏膜上皮（来自鼻咽癌患者正常侧活检），2例正常喉黏膜组织（来自喉癌患者）短期传代（≤4代）上皮细胞培养。
1.2 细胞培养 头颈鳞状细胞癌细胞系在RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100IU/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素）、载玻片培养瓶中培养。正常对照上皮组织剪碎后，在含180u/ml胶原酶Ⅱ、37℃下孵育过夜;然后放入胶原包被的载玻片培养瓶中培养。其培养液为角化细胞培养液（含0.23mg/ml的L-谷酰胺，100IU/ml青霉素，0.2mg/ml链霉素和2.5μg/ml两性霉素）。细胞大体生长状态是在倒置显微镜下观察，当细胞生长到90%时，拆除培养瓶顶壁，收获载玻片。
1.3 分裂细胞形态学检测 含有细胞的载玻片经PBS清洗5min后，在甲醇∶乙酸（3∶1）溶液中-20℃固定30min，空气干燥，苏木素和伊红染色。
1.4 中心体检测 含有细胞的载玻片经PBS清洗5min后，在甲醇溶液中-20℃固定30min，空气干燥。PBS再水化5min，含1%牛血清蛋白的PBS阻滞液作用15min，单克隆鼠抗γ-微管蛋白抗体（GTU88，Sigma）∶阻滞液（1∶40）孵育30min。PBS清洗3遍后，生物素标记的抗鼠抗体（E0354，DAKO A/S）∶阻滞液（1∶40）孵育30min。PBS清洗3遍后，用 链霉蛋白抗生素-Alexa594（Leiden）∶阻滞液（1∶50）孵育30min。75%、85%、100%酒精系列脱水，DAPI副染。
1.5 统计学方法 在光学显微镜下观察细胞分裂形态，每例实验对象至少分析150个分裂中期细胞。计算多极分裂形态细胞百分比。荧光显微镜下观察细胞中心体数目，每例实验对象至少分析60个细胞。计算含异常中心体数目细胞的百分比。两组数据行直线相关分析。HNSCC组和对照组两组数据平均值行t检验。
2 结果
HNSCC细胞系细胞分裂中期形态学分析发现大量3极、4极、多极的异常分裂形态，平均占分裂中期细胞的（9.9±4.8）%（图1）;而细胞中心体免疫荧光分析发现部分HNSCC细胞内含有3个、4个、多个甚至巨型的中心体聚集，平均占总体细胞的（6.7±3.1）%（图2）。且二者呈显著正相关，r=0.857，P<0.01（图3）。而正常对照组细胞仅偶尔出现异常分裂中期形态及异常的中心体数目，其平均值分别为（0.8±0.9）%和（1.2±1.4）%（图4，图5）。HNSCC组和对照组两组数据进行t检验，HNSCC组显著高于对照组，t值分别为4.50和4.01，P<0.01（表1）。
图3 HNSCC组细胞多极分裂中期细胞百分率（%）与中心体扩增细胞百分率（%）直线相关分析（略）
表1 HNSCC组和对照组细胞分裂中期形态学和中心体检测的研究结果（略）
3 讨论
中心体是细胞内小胞质细胞器，具有组织胞核和胞浆微管形成的作用。在细胞分裂中期，中心体作为分裂纺锤体的极端，决定细胞分裂的位置和方向 ［2］ 。分裂间期细胞只含1个中心体，常位于胞核附近，是由一对9个三联微管构成的圆柱体—微粒构成。中心粒附于含有成核微管蛋白γ-Tubulin的中心粒旁基质上 ［3］ 。在正常细胞周期，中心体仅复制1次，产生2个中心体作为纺锤体的分裂极，将细胞一分为二。这一过程主要是中心粒自身的复制过程，当细胞周期渡过G 1 期限制点开始DNA复制时，中心粒彼此分开一段距离，新生中心粒在原中心粒远端形成，在S期中心体复制结束。因此，仅有两个中心粒存在的细胞进入分裂期，才能保证姐妹染色单体平均分配入两个子细胞中 ［4］ 。另外，中心体作为分裂细胞微管组织中心，在调节细胞周期的过程中起重要作用。研究表明，激光或细胞显微手术移除中心体将导致细胞分裂失败或细胞静止于G 1 期 ［5］ 。在本研究中，HNSCC细胞系不同程度的表现了中心体扩增现象，并表现为异常的多极分裂形态，二者之间呈明显正相关。说明HNSCC中心粒异常扩增引起多极分裂纺锤体形成，导致染色体在子细胞中的错配，即染色体数目的增加或丢失，进而产生大量的基因失衡。
为确保中心体在每一细胞周期中仅复制1次，中心体的复制过程应严格与DNA复制、细胞分裂周期进程同步进行。以往研究证实中心体与DNA的复制都依赖于细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和转录因子E2F的活化引起的细胞周期G 1 ～S期的过渡 ［6］ 。根据以往有关中心体的研究，笔者推断两种可能的机制可导致HNSCC细胞内中心体的扩增。（1）某些癌基因的变异加速癌细胞进入S期，使中心粒异常复制，细胞内中心体聚集。（2）细胞周期检测修复基因功能失调，允许含有异常中心体的细胞存在并进入异常分裂期，使染色体错配入子细胞 ［7］ 。相反，中心体扩增引起的染色体数目失衡，进一步促进了癌基因与抑癌基因量变的不断积累，如此恶性循环，促进了HNSCC的恶性演变过程。
抑癌基因视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白磷酸化是第一种机制的典型。在人乳头瘤病毒（HPV）转染的上皮细胞体外实验中发现高度扩增的中心体和大量多极细胞分裂形态。在G 1 早期，Rb蛋白的低磷酸化形式即活化状态与转录因子E2F结合。致癌基因HPV的E7因子激活CDK2，促使Rb蛋白磷酸化并释放E2F因子，促进细胞周期G 2 期过渡至S期，进而加速中心体复制及异常增殖，以致细胞的多极分裂 ［8］ 。
在以往头颈部肿瘤的研究中发现，变异的p53基因存在常与中心体的扩增密切相关 ［9，10］ 。这便可以用第二种机制来解释。变异的p53基因降低了 p53维持G 2 静止期的能力，缩短了DNA修复检测的时间，同时可导致细胞分裂失败，最终导致大量癌细胞中心体的聚集 ［11］ 。
因此，通过本实验的研究发现，中心体的异常扩增及其导致的细胞多极分裂是HNSCC病程中的重要体现，由此产生的染色体数量失衡是HNSCC基因变异过程中的重要环节。通过对HNSCC细胞中心体表达和细胞分裂形态的检测和分析，及对中心体复制过程调控因子的理解，将对HNSCC诊断、治疗和预后起到重要的补充作用。
4 结论
HNSCC细胞内中心体过度表达，引起癌细胞多极分裂，导致染色体在子细胞中不断错误分配及数量改变，以致大量基因组变异，是肿瘤病因学重要的机制之一。
（本文图1、图2、图4、图5见附页2）（略）
参考文献
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11 Lingle WL，Barrett SL.Centrosome amplification drives chromoso-mal instability in breast tumor development.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:1979-1983.
（编辑文 静）
作者单位:16011辽宁大连大连医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科（△ 通讯作者）
200433上海第二军医大学长海医院骨科
130031吉林长春吉林大学中日联谊医院耳鼻咽喉头颈外科