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【摘要】 植片排斥仍是角膜移植成功的最大障碍，本文对角膜的抗原性、新生淋巴管在抗原提呈中的作用、植片排斥中的信号传导及前房相关免疫性偏离与免疫耐受关系的目前认识，以及目前对抗角膜移植排斥方法研究方面的进展进行了综述。
【关键词】 角膜移植；排斥；免疫学
【Abstract】 Allograft rejection is still the biggest obstacle to the success of corneal transplantation.This article reviews the current understanding in the antigenicity of corneal,the role of lymphangiogenesis in antigen presentation,the pathway of signal transferring in allograft rejection,the relationship of ACAID and tolerance of corneal transplantation,and current study in preventing corneal allograft rejection.
【Key words】 corneal transplantation;rejection;immunology
角膜移植可称为最古老、最成功的器官移植。然而，角膜移植排斥问题仍是导致移植失败的主要问题。对于角膜营养不良的病例进行角膜移植一般效果较满意，而对一些获得性的角膜混浊移植效果不及心、肾移植。有学者观察，对于新生血管化植床、再移植和一些急行移植手术的病例行角膜移植发生内皮免疫反应的比例是无新生血管化植床的角膜移植的10倍［1］。如何提高角膜移植的成功率，尤其是提高高危角膜移植成功率一直是学者们努力的方向。
1 参与角膜移植排斥的抗原
角膜植片的排斥需要3个过程：供体抗原的释放，识别并被传输到淋巴组织；抗原被处理，并产生特异性免疫细胞；机体通过细胞和体液免疫途径攻击移植片。有学者曾经通过实验证实角膜的上皮、基质和内皮均能够单独地诱发排斥反应［2］，说明HLA抗原在角膜的上述各层均可表达。研究证明：HLA Ⅰ类抗原主要表达于角膜上皮层，而极少在基质和内皮表达；HLA Ⅱ类抗原表达于角膜上皮和角膜基质，尤其在角膜缘部［3，4］。MHC配型是否能延长角膜植片的存活一直是目前争论的话题［5～7］，一个多中心的研究有419例患者经过HLA配型并没能有效减少排斥的发生［3］，而Reinhard等却发现HLA配型能够显著延长角膜植片的存活时间［2］，Vlker-Dieben等随访1681例角膜移植认为HLA配型能够显著延长角膜植片的存活时间［5，6］，有学者通过交叉配型实验发现受体对供体的抗HLA抗体的存在与角膜排斥并无直接关系［8］。有学者通过动物实验证明在角膜移植排斥中，相比MHC，次要组织相容性抗原具有重要意义，它可能是角膜植片存活的主要障碍。由此，MHC在启动角膜植片排斥中起重要作用而非全部，在低危的角膜移植中次要组织相容抗原在引起排斥方面起着重要作用［9］。MHC是参与抗原提呈的主要分子，它提呈的是肽类抗原，近来的研究发现，非肽类抗原也可以被提呈给T淋巴细胞引起免疫反应［10］，通过CD1分子，可将脂类和糖类抗原识别、提呈并引起免疫反应［11］。血型抗原在植片排斥中的作用也引起了人们的重视［12］，虽然血型抗原是不会引起T细胞攻击的糖类，但在血浆酶的作用下就具有了抗原的结构。
2 新生淋巴管与抗原提呈
抗原提呈是引起免疫排斥的关键环节，目前已知的参与抗原提呈的细胞有朗罕细胞（Lanhgerhans cell，LHC）、巨噬细胞（macrophages，MΦ)和树突状细胞（dendritic cell，DC），正常角膜组织没有抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APC）的存在，对抗原提呈过程中的APC的移行目前并没有明确的认识，有学者用绿色荧光蛋白转基因鼠作供体行角膜移植后，发现携带角膜抗原的绿色荧光蛋白APC聚集于同侧的颈部淋巴结中［13］，Yamagami［14］发现切除小鼠双侧颈部淋巴结可以100%抑制角膜排斥发生，92%高危角膜移植可长期存活，最近有研究表明角膜移植术后在出现新生血管的同时往往有新生淋巴管的出现［15］，在一定的刺激下新生淋巴管可独立出现，同时在角膜移植排斥的病人并不是全部出现新生血管，以上种种均提示新生淋巴管在抗原提呈中可能扮演着独特的角色，对新生淋巴管的深入研究可能为抗角膜移植排斥提供一个新的思路。
3 角膜排斥中的信号传导
在器官移植的急性排斥反应和加速性排斥反应中，最早识别带有外源性MHC器官的细胞是CD4+T。由于CD4+T细胞的活化、分泌细胞因子，可激活CD8+T细胞和B细胞而引起免疫应答，最终将移植片排除。首先，CD4+T淋巴细胞表面受体（TCR）与APC细胞表面的MHC Ⅱ类分子结合形成复合体（TCR/MHC），对抗原进行识别，进而通过信号的传递使CD4+T淋巴细胞活化、增殖，并产生多种淋巴因子，在这些淋巴因子的作用下，CD8+T淋巴细胞活化增殖，并对角膜植片表现细胞毒性作用。因此，阻断TCR/MHC复合体的形成就会延长角膜植片的存活，有学者通过实验证明应用抗CD4单克隆抗体可显著延长角膜植片的存活时间［16］。在静止T淋巴细胞的活化过程中，信号的传递是通过TCR/CD4复合体共刺激途径完成的，共刺激信号的传递并非通过提供抗原，而是通过TCR触发并介导放大信号，共刺激信号由细胞表面分子CD28传导。CD28分子有两个配体，是位于活化的APC细胞表面的CD80（B7-1）和CD86（B7-2）。与CD28的结合可使T细胞充分活化，当在没有CD28参与而与T细胞的触发则会使T细胞无反应或凋亡［17］。活化的T淋巴表面表达的CTLA-4（CD152）分子也可以与CD80/CD86结合，一般认为是对T淋巴细胞发出负反馈信号产生抑制作用［18］。有实验证明CTLA-4Ig结合蛋白可竞争与CD80/CD86的结合，阻断共刺激信号的传递，使角膜植片的存活时间延长［19］。CD154（CD40L）是又一个被发现的共刺激途径，它表达于活化T淋巴细胞表面，是TNF家族成员，可与CD40相结合，CD40是TNF受体家族成员，表达于包括APC细胞的多种细胞表面［20］。应用抗CD40L的单克隆抗体阻断CD40/CD154的相互作用，可使角膜植片存活时间延长［21］。
4 ACAID与角膜移植的免疫耐受形成
目前认为，角膜的免疫赦免已经超出了角膜的无血管因素，而更与前房有关，称之为前房相关性免疫偏离（anterior-chamber-associated immune deviation，ACAID）,它主要表现为对抗原特异性的迟发性超敏反应的抑制；对补体结合抗体的抑制；对其他体液免疫的保留。ACAID的发生与调理T细胞所释放的可溶的细胞成分有关［22］，眼前节的正常结构及免疫微环境的存在是ACAID的前提，这其中是通过复杂的细胞因子网络相互制约和调控的结果。Sonoda通过动物实验证实这是一个特异性的压制迟发型超敏反应（delayed-type hypersensitivity，DTH）的过程［23］。
4.1 CD4+T细胞在角膜移植免疫耐受中的作用 CD4+T细胞受抗原刺激后可分化为Th1与Th2两个亚群，分别分泌不同的细胞因子，Th1分泌IL-2、IFN-γ及TNF-β等，Th2分泌IL-4、IL-10及IL-13等。Th1细胞介导引起角膜植片排斥的DTH，Th2细胞的作用是对Th1细胞的作用进行调理和约束［24］。通过动物实验发现，在移植排斥的角膜植片和房水中可检测到由Th1细胞所主导的免疫反应所产生细胞因子［25］。因此可通过增强Th2细胞的作用和抑制Th1细胞的作用使角膜植片的存活增加，诱导机体对移植物的耐受。Takeuchi等将经输血而产生免疫耐受的小鼠脾脏中的单核细胞提取后注入经全身淋巴照射的未经免疫的小鼠，可诱导此小鼠产生抗原特异性免疫耐受，当用抗FcR mAb去除其中的Th2（只有Th2细胞表面表达FcR）可阻止免疫耐受的形成。因此认为CD4 Th2细胞能调节免疫耐受的“传染”［26］。IL-4被认为是促进Th2细胞反应的关键因子，已被用于自身免疫病模型的器官移植中并取得良好效果［27］，通过IL-4和IL-10基因的同时转染可延长角膜植片的存活。
4.2 CD1d反应NKT细胞与ACAID及诱导免疫耐受的关系 CD1d反应NKT细胞（CD1d-reactive natural killer T cells)在Th2型免疫反应的作用已经引起了人们的重视，Sonoda等［28］报道在ACAID中CD1d反应NKT细胞对抗原特异性Tr细胞的发育起着关键性作用。CD1d的表达于APC细胞表面的单一形态的、非MHC编码的、类MHC Ⅰ类分子的抗原提呈分子［29］，NKT细胞是同时表达TCRαβ链和NK表面标志的淋巴细胞［30］，鼠类NKT细胞表面表达恒定的Vα14Jα281 TCRs,它可以识别与CD1d结合的磷脂类和糖脂类抗原，αGalCer(α-Galactosylceramide)可与TCR结合并活化NKT细胞。在NKT细胞由αGalCer活化后常表现Th2型免疫反应，IL-4的活性超过IFN-γ的活性而占主导作用，促进CD4+T细胞分泌Th2型的细胞因子，IgM水平升高，IgG2a水平下降［31］。在Sonoda的实验中［32］，角膜植片的长期存活需要CD1d反应NKT细胞的存在，正常小鼠和去除NKT细胞的小鼠分别作为受体进行同种异体移植，结果发现在移植早期6周内二者的排斥率无明显差别，但在移植12周后，正常小鼠和NKT细胞敲除鼠的植片存活率分别为50%和0，因NKT细胞对于植片的存活是必要的。NKT细胞与ACAID有关，表现为选择性的DTH丧失和免疫球蛋白结合补体的能力丧失。角膜移植术后植片长期存活者表现为DTH丧失，而术后发生DTH者总是会导致植片排斥。研究发现，缺乏NKT的小鼠前房接种抗原后，不能诱导ACAID和Tr细胞产生，如果重新给它们输入NKT细胞，则又表现为ACAID恢复，而且发生ACAID的小鼠脾中NKT细胞明显升高。NKT细胞的发育需要CD1d分子，在CD1d敲除小鼠体内会出现NKT细胞的选择性的缺失［33］。同时，只有当NKT细胞与CD1d分子的结合才能诱发免疫耐受的出现，当CD1d分子被CD1d特异性抗体封闭时，就会阻止抗原特异性Tr细胞的发育［34］。
5 抗角膜移植排斥策略与展望
5.1 药物 目前应用于抗角膜移植排斥的药物主要有两大类：化学免疫抑制剂和抗体类药物。化学免疫抑制剂药物主要有：非特异性抗增殖类药物，代表药物有皮质类固醇激素；抑制IL-2生成的药物，包括CsA、KF506；抑制生长因子传递的药物，代表药物雷帕霉素；特异性抑制淋巴细胞增殖的药物，代表药物有霉酚酸酯（mycophenolatemofetil)。抗体类药物：针对细胞因子及其受体的生物制剂，如抗IL-2R单克隆抗体、抗IFN-γ的单克隆抗体、TNF的拮抗剂；抗黏附分子的单克隆抗体；阻断共刺激信号的单克隆抗体和融合蛋白，如CTLA4Ig、抗CD154单克隆抗体。
5.1.1 传统免疫抑制剂 传统免疫抑制剂在特异性方面存在缺陷，非特异性抗增殖类药物对淋巴细胞、粒细胞和单核细胞均有抑制作用。钙神经素抑制剂（CsA、KF506）主要通过阻断细胞质内的Ca2+依赖的信号传导途径降低IL-2的基因转录，抑制淋巴细胞的活化达到抗移植排斥的作用，但长期应用具有肝、肾和神经毒性。雷帕霉素抗角膜移植排斥的作用已得到证实［35］，它作用于IL-2后信号系统，减少细胞周期中的G1相向S相转化，从而阻断T细胞的增殖过程，有学者通过实验证明雷帕霉素具有抑制新生血管和抗角膜排斥的双重作用。霉酚酸酯具有选择性抑制 T、B淋巴细胞DNA的合成，而对非淋巴细胞无抑制作用，因此无传统免疫抑制剂的肝肾不良反应，在高危角膜移植中具有与CsA相同的作用［36］。
5.1.2 抗体类药物 为了提高药物作用的特异性，研究者们把目光转向了以抗体为基础的生物制剂，目前认为解决排斥反应的关键是诱导产生对供体的特异性免疫耐受，传统的免疫抑制剂会抑制免疫耐受的形成，通过抗体类药物可对特异性淋巴细胞进行调控，诱导产生免疫耐受。单克隆抗体的高度特异性是诱导免疫耐受的关键。抗体类免疫抑制剂以特定的免疫细胞表面结构为作用靶向，具有高度特异性，但单克隆抗体也存在一些问题：首剂的过敏反应、受体产生针对治疗性抗体的抗体、药代动力学等问题。
5.2 提高供受体组织相容性
5.2.1 组织配型 在大器官移植中，为了减少排斥反应通常要进行组织配型以提高供受体间的组织相容性。MHC配型在抑制角膜移植排斥的研究中有不同的观点［5～7］，Fink研究发现［37］：ABO抗原配型的角膜移植患者3年后发生排斥的占16%，而不配型的排斥率为30%。有学者还发现，与HLA相比，次要组织相容性抗原的不匹配发生的角膜移植排斥明显增高［9］。以上种种使我们发现，通过抗原配型减少角膜移植排斥在实际工作中操作很不现实。
5.2.2 降低供体移植物的抗原性 MHC抗原存在于细胞表面，其本身既是重要的移植抗原，又同时对其他抗原起提呈作用。因此，如何能够降低MHC抗原的表达对提高供受体的组织相容性，减少移植排斥是值得人们探讨的问题。Busch将表达抗大鼠MHC Ⅰ类抗原分子抗体的基因转入大鼠皮肤上皮细胞，对MHC Ⅰ类抗原的表达产生了明显的抑制作用［38］。Backman将表达受体MHC Ⅰ类抗原分子的基因转入供体细胞内，证明可以使其免于受体NK细胞的攻击［39］。
5.3 基因治疗 基因治疗是指通过特定靶细胞表达原本不表达的目的基因，或通过特定的方式关闭、抑制异常表达的基因，以达到治疗疾病的目的。由于眼睛位置表浅，角膜内皮是单层结构，角膜植片易于保存和操作简便的特点，使得角膜植片在手术之前易于进行基因修饰。有学者通过重组腺相关病毒载体将目的基因转染到角膜内皮细胞，通过目的基因的表达成功地控制眼内炎症［40］。对于基因治疗在角膜移植中的应用，目的基因的获取及转染载体的安全性是关键性问题。
5.4 其他
5.4.1 RNA干扰技术（RNAi） RNA干扰技术是通过人工合成的小分子干扰RNA（siRNA)特异性地抑制、降解同源mRNA序列，有效阻止相应蛋白质的表达。体外合成的siRNA具有分子量小、穿透力强的特点，其药代动力学特性与普通化学合成药物基本相同。Sato Y通过动物实验证实［41］，siRNA可通过基因修饰下调移植物的内源性抗原达到抗移植排斥的目的。相信随着RNAi技术研究的不断深入，其在抗角膜移植排斥的作用方面必将有一个广阔的前景。
5.4.2 计算机辅助药物设计技术（computer-assisted drug design,CADD) 在抗原的识别、淋巴细胞的活化增殖过程中，细胞表面与细胞识别相关的蛋白分子接触是受严格限制的，因此，人们想到如果能有一种药物可以和这些蛋白质分子的某些结构相结合，就可以阻断信号的传递，达到控制免疫过程的目的。Connolly首先提出了靶标分子几何空间构象的DOCK概念［42］，DOCK是目标靶分子的三维结构中与其配体结合并发挥其生物学效应的部位。基于此人们通过CADD设计出药物。它的基本过程是：通过实验得到目标靶分子的三维结构，运用计算机技术将已知空间构象的化合物进行筛选，得到与目标靶分子DOCK结构相匹配的药物，通过体内、外实验验证该药物的有效性。Song Li［43］基于CD4分子的domain1的DOCK3.5结构，通过CADD技术从约150 000小分子非肽类有机化合物中筛选出4种药物TJU101-104，在体外实验中具有良好的抑制CD4分子与MHC Ⅱ分子结合形成复合体的作用，通过动物实验证明具有良好的抗排斥作用。小分子非肽类免疫抑制剂与传统免疫抑制剂相比具有特异性高、副作用少的特点，没有抗体类药物的抗原性问题，为抗角膜排斥反应提供了一个新的思路，其在角膜移植中的应用价值是一个有研究前景的领域。
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(编辑：乔 晓)
作者单位： 100853 北京，解放军总医院眼科