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【摘要】 目的 通过动物实验，探讨平喘合剂治疗儿童哮喘的作用机制。方法 40只大鼠随机分为正常组、模型组、博利康尼组、痰喘丸组、平喘合剂组，分别测定各组大鼠血浆和肺泡灌洗液（BALF）中IL-2、IL-4、TNF-α、ET-1含量及肺组织嗜酸粒细胞（EOS）凋亡情况。结果 平喘合剂具有良好的解痉平喘、抗炎作用。结论 平喘合剂治疗儿童哮喘的作用机制与抑制气道炎症等机制有关。
【关键词】 平喘合剂；儿童哮喘；实验研究
Experimental studies on juvenile bronchial asthma treated with pingchuan mixture
XING Xiang-hui,CAO Hong,PAN Yue-li,et al.
Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250011,China
【Abstract】 Objective Through experimental studies,to research the cure mechanisms of pingchuan mixture to juvenile bronchial asthma.Methods 40 male rats were randomly divided into normal group,model group,bricanyl group,Tan Chuan Wan group and pingchuan mixture group,then to measure the level of IL-2,IL-4,TNF,ET-1 in plasma and BALF and the apoptosis of EOS in lung tissue.Results Pingchuan mixture exert good effects on spasm,asthma and inflammation.Conclusion The mechanism of pingchuan mixture associated with depressing the airway inflammation.
【Key words】 pingchuan mixture;child asthma;experimental study
支气管哮喘是一种以肥大细胞反应、嗜酸粒细胞（EOS）浸润为主的气道慢性炎症性疾病，严重威胁人类特别是儿童的身体健康。近年来，全球发病率和死亡率均呈上升趋势，为探索其发病机制，寻求其有效的防治药物已成为当前的研究热点。平喘合剂是我们多年来治疗儿童哮喘发作期的有效方剂，为探讨其作用机制，我们进行了平喘合剂治疗哮喘的实验研究，现总结报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物选择 健康雄性Wistar大鼠40只，体重（200±10）g，由山东大学实验动物中心提供，符合一级实验动物标准。
1.2 药物配制
1.2.1 平喘合剂药物组成 炙麻黄、炒杏仁、细辛、清半夏、炒苏子、川芎、炒地龙、黄芩、沉香、甘草等，由山东中医药大学附属医院中药制剂室按正交试验法筛选工艺，以最佳流程制备，每毫升药液含生药约1g，浓缩成1.27g/ml的浓度，250ml/瓶。
1.2.2 博利康尼 用生理盐水配成0.083mg/ml的浓度。
1.2.3 京制咳嗽痰喘丸 用生理盐水配成0.14g/ml的浓度。
1.3 药品与试剂 液体石蜡，天津市新精细化工开发中心（批号：980908）。羊毛脂，中国嘉定华亭羊毛脂厂（批号：990403）。冻干卡介苗制剂60mg/支，兰州生物制品研究所（批号：20010610）。卵清蛋白（OA）冻干粉10g/支，北京鼎国生物技术发展中心，Sigma分装（批号：20011222）。TNF-α、IL-2、IL-4试剂盒（ELISA），深圳晶美公司。ET-1试剂盒（放射免疫），购于北京东亚放免所。
1.4 动物造模与分组 取体重为（200±10)g的雄性Wistar大鼠40只，随机分为5组，A：正常组，B：模型组，C：博利康尼组，D：痰喘丸组，E：平喘合剂组，每组8只（经统计学处理，组间体重差异无显著性）。除正常组外，余4组进行造模，方法如下：抗原液的制备参考林清华主编的《免疫学实验》，并根据以往经验稍做改进［1，2］。称取5g优质羊毛脂置研钵中，逐滴加入液体石蜡油40ml，水浴混匀，装入小磨口瓶内，高压（0.14mPa）蒸汽灭菌20min，冷却后倒入无菌研钵中，按每毫升加入50mg卵清蛋白、10mg卡介苗，慢慢研磨，制成乳白色混悬液作为抗原液备用。取1ml抗原液于大鼠背部选4个点进行皮下注射，正常组则以等量生理盐水代替。抗原接种后休息5天，从第6天开始卵清蛋白雾化吸入激发，至引喘成功。
1.5 实验方法
1.5.1 给药方法 将造模成功后的大鼠进行药物灌胃，药物用量按陈奇提供的常用动物与人的药量换算公式计算（D2=D1·R2/R1）［3］。C、D、E组均每次给予相应的药物（0.5ml/100g体重），每日2次，A、B组以等量的生理盐水代替，共喂养7天。
1.5.2 取材 激发试验后24h用0.4%戊巴比妥钠麻醉（1ml/100g体重）大鼠，腹主动脉取血，EDTA-2Na（乙二胺四乙酸二钠）抗凝，以3000r/min离心5min，取血浆代用。取血后处死动物，结扎左主支气管，用气管套管插在主支气管上，结扎固定，行右支气管肺泡灌洗。针管内抽6ml生理盐水，缓慢推进，保留20s，然后缓慢抽回，共操作3次，收集肺泡灌洗液（BALF）4ml。以3000r/min离心5min，取上清液待用。
1.6 观察项目
1.6.1 引喘潜伏期 实验第13天将致敏大鼠放在玻璃钟罩内，用1%的卵清蛋白生理盐水以5ml/min的流速进行喷雾，每次喷20min，观察至喷雾停止后10min，记录大鼠出现喘息的情况（表现为四肢挠抓，躁动不安，伴有呼吸加速，腹部内陷起伏等呼吸困难症状）。正常组以生理盐水代替。
1.6.2 血浆及BALF中TNF-α、IL-2、IL-4的含量测定 取抗凝血以3000r/min离心5min，取血浆待用。采用ELISA法测血浆及BALF中TNF-α、IL-2、IL-4的含量。（具体步骤按试剂说明进行操作）。
1.6.3 血浆及BALF中ET-1的含量测定 用放射免疫法测血浆及BALF中ET-1的含量（具体步骤按试剂说明进行操作）。
1.6.4 肺组织EOS凋亡检测 肺组织经常规固定（中性甲醛）、脱水、切片至水化，TUNEL法用地高辛介导过氧化物酶联显色，细胞核有黄色颗粒者为阳性细胞。在高倍视野下随机选择5个视野，计总细胞数和凋亡细胞数，根据以下公式计算细胞凋亡率。凋亡细胞阳性率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
2 实验结果
2.1 平喘合剂对哮喘模型大鼠引喘潜伏期的影响 正常大鼠引喘不敏感，没有明显的喘息表现，仅有短暂的呼吸增快，很快恢复正常。引喘时出现，说明造模成功。引喘时出现四肢挠抓，躁动不安，伴有呼吸加速，腹部内陷起伏等呼吸困难症状时，作为哮喘模型大鼠的引喘潜伏期。见表1。
表1 平喘合剂对哮喘模型大鼠引喘潜伏期的影响 （略)
2.2 平喘合剂对哮喘模型大鼠血浆和BALF中IL-2、IL-4、TNF-α、ET-1含量的影响 见表2。
表2 平喘合剂对哮喘模型大鼠血浆和BALF中IL-2、IL-4、TNF-α、ET-1含量的影响 （略)
2.3 平喘合剂对哮喘大鼠肺组织EOS凋亡的影响 见表3。
表3 平喘合剂对哮喘模型大鼠肺组织EOS凋亡的影响 （略)
3 讨论
现代研究认为，支气管哮喘是气道慢性变应性炎症性疾病，以气道高反应性和可逆性气道阻塞为主要特征，气道黏膜的慢性非特异性炎症是哮喘发病的病理学基础，是导致气道高反应性、支气管痉挛的主要原因。在哮喘炎症过程中有多种炎性细胞参与，目前认为EOS是哮喘气道炎症的主要效应细胞，大多数炎性细胞最终通过EOS产生效应［4］。IL-2是免疫系统中关键的调控因子，具有促进T淋巴细胞分化增殖的作用，并可增强B细胞合成各种抗体的能力，在人体对抗原的免疫应答中起重要作用。IL-4可以促进B淋巴细胞增殖，促进IgE的合成，且IL-4基因或其附近基因调节血清总IgE的合成，进而促肥大细胞释放颗粒，引起气道高反应性、黏膜水肿、黏液分泌增加、支气管痉挛；还能促进巨噬细胞分泌各种炎性介质，诱导血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）的表达，从而诱导人嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞对内皮细胞的黏附作用［4］。本研究表明：平喘合剂可明显降低哮喘患儿外周血EOS计数，降低患儿血浆中IL-4水平，明显提高血浆中IFN-γ的含量；实验亦证明，平喘合剂能明显促进哮喘模型大鼠肺组织EOS凋亡，可明显改善哮喘模型大鼠血浆中IL-2、IL-4的含量的异常升高，效果优于博利康尼组和痰喘丸组，且短时间内可降至正常。
内皮素（endothelin，ET）是一种分子量为228kD的活性多肽，是重要的炎性介质。人支气管和肺泡上皮细胞都能合成和释放ET，并在支气管平滑肌细胞上存在ET受体。目前研究认为ET-1在哮喘中的作用主要有：（1）具有很强的支气管平滑肌收缩作用，有学者认为它是目前作用最强的使血管及气道平滑肌收缩的炎性介质；（2）激活磷脂酶，促进花生四烯酸的代谢，促进LT、PAF、PG、TXB2和OFR的合成和释放，加重炎症反应；（3）增加血管通透性，促进炎性细胞向气道内聚集；（4）损伤气道上皮细胞，增加气道反应性［5］。实验表明：平喘合剂可明显改善哮喘模型大鼠血浆、BALF中ET-1含量的异常升高，效果优于博利康尼和痰喘丸，且短时间内可降至正常。提示平喘合剂具有良好的解痉平喘、抗炎作用，其治疗机制与减轻气道阻塞、改善通气功能、调节免疫反应和抑制气道炎症等多个环节有关。
【参考文献】
1 林清华.免疫学实验.武汉：武汉大学出版社，1999，37-38.
2 吕国平，崔德建.介绍一种建立大鼠哮喘模型的实验方法.中华结核和呼吸杂志，1995，8（60）：377-379.
3 陈奇.中药药理研究方法学.北京：人民卫生出版社，1993，33-36.
4 Lampinen M, Hakansson L, Venge P. Interleukin-2 inhibits eosinophil migration but is counteracted by IL-5priming, Clin Exp Allergy,2001,31(2):249-258.
5 Michael JR. Endothelins and the lung. Am J Respir Crit Care med,1996,556-581.
基金项目： 山东省教委资助课题（项目编号：J99K54）
作者单位： 250011 山东济南，山东中医药大学附属医院小儿科
(编辑：宋 青)