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【摘要】 目的 本文报告1例曾生育1胎同源罗式易位先天愚型儿的中孕妇女，用双色荧光原位杂交（FISH）检测未培养羊水细胞，产前诊断先天愚型的研究。方法 （1）选择LSI21（红色标记）及CEP18（绿色标记）DNA探针，对未培养羊水行双色FISH，同时作常规细胞培养。（2）对引产胎儿实体组织直接制备间期细胞，行21号染色体单色FISH分析。结果 （1）96%羊水细胞显示3红、2绿荧光信号。（2）羊水培养胎儿核型为46，xx，-21，t（21;21），与第一胎基本类同。（3）引产物90%以上细胞有3个红色荧光信号。以上三项检测结果一致。结论 FISH是一种新型产前诊断失天愚型的有效方法。直接制备胎儿实体组织间期细胞行FISH分析，验证产前诊断准确性方法快速、简便。本例二次生育同源罗式易位先天愚型，病例实属罕见。
technique in uncultured amniotic fluid interphase cells
Yu Shirong，Liu Yanqiu，Li Yuzhong，et al.
Jiangxi Provincial Women and Children Health Hospital，Nanchang330006.
【Abstract】 Objective To report a case of Down’s syndrome diagnosed by FISH technique in uncultured amniotˉic fluid cells，prenatally in the second trimester，who had a baby with Down’s syndrome of homologous Robertsonian Translocation before.Methods （1）Dual-color FISH detection in uncultured amniotic fluid with red LSI21and green CEP18DNA probes was done.The cells were also cultured at the same time.（2）The interphase cells directly prepared from the tissue of labor induction fetus were examined with single-color FISH probe for twenty-first chromosomes. Results （1）96%amniotic cells showed three red and two green fluorescence signals.（2）The karyotype of cultured amˉniotic fluid cells was46，xx，21，t（21;21），the same as that of her first baby.（3）More than90%cells of labor induction fetus had three red signals.Above three results were consistent.Conclusion FISH is a new，effective method for prenatal diagnosis of Down’s syndrome.The FISH detection of directly prepared interphase cells of fetus tissue is quick and simˉple，can confirm the correctness of prenatal diagnosis.This case having two babies with Down’s syndrome of homologous Robertsonian Translocation，was really very rare.
Key words D-FISH uncultured fluid cell prenatal diagnosis mongolian
21三体综合征（Trisomy21syndrome）又称先天愚型或唐氏综合征。发病率占所有染色体疾病中的首位，是产前诊断中常见的疾病。约95%的病人为单纯性，3%～4%为易位型，其余为嵌合型。罗伯逊易位（Robertsonian translocation，rob）简称罗式易位，是指发生在D组与G组通过着丝粒融合而成的易位。荧光原位（fluorescenceinsituhybridization，FISH）是近年来发展迅速的现代生物学技术是一种快速检测先天愚型的方法 ［1］ 。它能用直接标记的21号染色体特异位点DNA探针，观察间期细胞中21号染色体的畸变情况。本文通过1例有同源罗式易位先天愚型儿产史的中孕妇女，用FISH技术检测其未培养羊水细胞，产前诊断先天愚型的研究，报告如下。
1 资料与方法
1.1 病例摘要 孕妇，女，27岁，孕2产1，停经4个月，未次月经2004年1月24日。第1胎先天愚型，1岁半，核型46，xx，-21，t（21;21）。为防止再次生先天愚型儿，于2004年5月26日来本院要求产前诊断，产检及B超检查符合18周。2004年5月27日行羊膜腔穿刺，抽羊水25ml分成2份，20ml送羊水细胞培养，另5ml留FISH检测。夫妇双方身体健康，外周血染色体检查正常。家族中无类似患者，无烟酒嗜好及任何有毒物品接触史。
1.2 方法
1.2.1 未培养羊水及胎儿实体组织间期细胞的制备 取羊水5ml→离心→留底物→加2∶1为0.7%枸橼酸钠∶0.075mol氯化钾混合液10ml混匀（胎盘、胎肝、胎肾取10～15mg组织剪碎捣成泥浆状→加1%枸橼酸钠4ml混匀）→置37℃水浴中低渗20～30min（胎盘低渗12～14min）→加0.5ml3∶1为甲醇:冰乙酸固定液混匀后→离心5min→留底物→加固定剂5ml固定15min→再重复固定1次→（胎盘、胎肝、胎肾再用1∶1为冰乙酸:蒸馏水混合液0.3ml解离细胞30s～1min，加固定剂1ml）→离心→去上清液加1ml固定剂制成细胞悬液→置入-20℃冰箱备用。1.2.2 FISH的制备 （1）杂交前予处理及玻片变性:取上述细胞悬液滴置玻片上→气干→干热→2×SSC温育30min→0.01NHCL胃蛋白酶溶液中消化30～40min→1×PBS洗片→乙醇系列脱水→72℃变性液中变性→置冰乙醇系列脱水。（2）探针变性:取CEP18p11.1-q11.1（绿色标记）DNA探讨0.5μl与LSI21q22.2（红色标记）DNA探针0.4μl，加杂交液3.5μl，加蒸馏水0.6μl（单色FISH:取探针0.5μl，杂交液3.5μl，加蒸馏水1μl）混合后→置73℃水浴中变性→置冰中。（3）杂交及杂交后清洗:将5μl上述杂交混合液于杂交区→封边→置杂交仪14～16h→弃去盖玻片→置73℃1×SSC液洗涤→置PBS液中清洗→加DAPI复染→封片。（4）检测结果:荧光显微镜下通过3色滤光片观察不同荧光信号，羊水计数100个间期细胞，实体组织计数200个间期细胞。
2 结果
2.1 产前宫内诊断1例先天愚型 （1）未培养羊水间期细胞双色FISH显示，96%的间期细胞有3红2绿双色荧光信号，见图1。（2）羊水细胞培养胎儿核型为46，xx，-21，t（21;21），见图2。
2.1.2 引产后证实为先天愚型 （1）胎盘、胎肝、胎肾单色FISH分别98%、92%、93%间期细胞显示，有3个红色荧光信号，见图3～5。（2）体格及病理检查:外观眼距稍宽，小眼，伸舌，颈部皮肤水肿，一侧通贯掌，体内器官未见明显畸形，见图6。
3 讨论
3.1 FISH是快速诊断先天愚型的有效方法 常规诊断先天愚型，是依靠羊水细胞培养与分析。需要时间长，技术难度大，不易普及与推广。近年来出现一些快速检测先天愚型的方法，如荧光原位杂交及荧光定量PCR技术等 ［2～3］ 。本研究利用FISH技术，对1例曾生育过先天愚型儿的孕妇，再次妊娠18周行产前诊断。仅用24h，检出1例先天愚型儿。与羊水培养及胎儿实体组织FISH分析结果一致。表明:FISH是快速产前诊断先天愚型的有效方法， 是广泛开展唐氏生化筛查阳性病例，进行确诊的重要手段之一。有一定临床实用意义。
3.2 直接制备胎儿实体组织间期细胞方法的探讨 传统验证产前诊断准确性的方法，除羊水细胞培养外，其次是胎儿实体组织细胞培养。G显带染色体分析。由于引产后胎儿已死亡，有活性的细胞少，无菌操作十分困难，培养成功率低，至少要10～14天出结果。FISH技术除可分析中期分裂相，还可分析占比例多的间期细胞 ［4］ 。本研究直接制备胎儿实体组织间期细胞行FISH分析，成功的为1例产前诊断的准确性进行了验证，24h出结果。从细胞形态、数量、信号强度，杂交率均达到十分理想的效果。表明:直接低渗制备胎儿实体组织间期细胞行FISH分析，是验证产前诊断准确性的快速，简便方法。
3.3 二次妊娠同源罗式易位先天愚型的病因探讨 95%的罗伯逊易位为非同源性，同源性仅占少数。90%同源罗式易位都是等臂染色体，含单个着丝粒，为新发生的突变。没有亲代偏离倾向，双亲突变比例各占50% ［5］ 。唐氏综合征再发风险1%～2%，如一对夫妇多次发生唐氏儿，可能是生殖细胞减数分裂出现不分离，与基因调控有关 ［6］ 。本文报告连续2次妊娠同类型先天愚型儿，病例实属罕见。从家系调查亲属中无类似病儿，夫妇外周血染色体正常，无明显物理、化学、生物致畸因素接触史。产生的原因，可能是亲代一方生殖细胞在减数分裂时，基因调节失控，导致:1条21号染色体于着丝粒发生断裂后，长臂复制形成21号等臂染色体或2条21号染色体于着丝粒发生断裂后重接。这样含2个21号染色体成分的罗式易位型配子，与另一方有一条21号染色体的配子结合，形成的合子为罗式易位型21三体。为防止再次生育同类患儿，本研究需进一步检查导致额外21号染色体的双亲起源，并在PGD技术的指导下生育。（本文图片略）
参考文献
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作者单位:330006江西南昌江西省妇幼保健院
（收稿日期:2004-08-26）
（编辑文 川）