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【摘要】 目的 体外观察三氧化二坤（As 2 O 3 ）、顺铂（DDP）单用和合用对SKOV3细胞黏附、转移等生物学行为的影响及相关机制探讨。 方法 采用直接计数法检测As 2 O 3 、DDP作用于SKOV3细胞48h后对细胞黏附能力的影响，计算相对黏附率。采用免疫细胞化学法观察As 2 O 3 、DDP作用48h后，SKOV3细胞CD44V6、E-cad、MMP2表达的改变。 结果 （1）As 2 O 3 、DDP单用或合用均能明显减弱SKOV3细胞的黏附能力，且具有浓度依赖性。联合组作用强于单用药物组。（2）As 2 O 3 能轻微上调SKOV3细胞E-cad蛋白的表达，降低MMP2表达，明显降低CD44V6蛋白的表达，DDP及联合组也能降低CD44V6及MMP2蛋白的表达，但对E-cad蛋白的表达无影响。 结论 As 2 O 3 、DDP均能明显抑制SKOV3细胞的黏附能力，其抑制机制与二者下调CD44V6、MMP2表达有关，而As 2 O 3 还能同时上调E-cad蛋白表达使癌细胞不易脱落播散。
关键词 三氧化二砷 卵巢肿瘤 黏附
The effects of As 2 O 3 and DDP on the adhesion and metastasis of human ovarian cancer cell line SKOV3
Zeng Yuhua，Yang Zhining，Tang Liangdan，et al.
The Affiliated Hospital of North Sichuan University of Medical Science，Nanchong637000.
【Abstract】 Objective To explore the effect and the related mechanism of As 2 O 3 and DDP alone or in combi-nation on the adhesion and metastasis of SKOV3cells.Methods Cells adhesive capacity was determined after48hours exposure to As 2 O 3 and DDP alone or in combination.Immunocytochemical staining was used to examine the ex-pression of CD44V6，E-cad and MMP2of these cells.Results As 2 O 3 and DDP alone or in combination could in-hibit SKOV3cells adhesion in a dose-dependent fashion，and the inhibitory effect was more significant in the com-bined group.As 2 O 3 could slightly upgrade the expression of E-cad and significantly downregulate the expression of CD44V6.The combined group was more striking in changing the expression of CD44V6.MMP2could be decreased by As 2 O 3 and DDP with no relation to concentration.Conclusion As 2 O 3 could decrease the cell adhesion capacity and inhibit tumor metastasis through downregulating expression of CD44V6and MMP2，even upgrading E-cad ex-pression.As 2 O 3 and DDP combination could manifest a better antimetastasis effect.
Key words arsenic trioxide ovarian neoplasm adhesion
理想的抗肿瘤药物应同时具有多个作用靶点，能从多条途径抑制肿瘤生长及发展。上皮性卵巢癌患者早期即可有盆腹腔内广泛种植、播散及转移，常常影响卵巢癌患者的预后。细胞黏附是肿瘤细胞转移的主要环节之一，肿瘤细胞对细胞外基质的黏附性及各黏附相关蛋白的表达是评价细胞黏附、转移能力的重要指标。
前期研究表明三氧化二砷（As 2 O 3 ）、顺铂（DDP）单用和合用具有明显的抑制SKOV3细胞增殖的作用，本研究在此基础上，进一步探讨As 2 O 3 、DDP对SKOV3细胞黏附能力的影响及其对SKOV3细胞黏附、转移相关蛋白CD44V6、E-cad、MMP2表达的影响，以期探讨As 2 O 3 抗卵巢癌的其他机制，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 人卵巢癌细胞株SKOV3细胞，以含10%小牛血清的RPMI1640培养液传代培养，实验所用细胞均为对数生长期细胞。
1.2 药物及试剂 0.1%亚砷酸注射液（As 2 O 3 ）（10ml/支，哈尔滨伊达药业有限公司，批号:20001105）;顺铂粉剂（DDP）（山东齐鲁制药厂产品，批号:021015）。使用时用RPMI1640培养液稀释至所需浓度。层粘连蛋白（LN）及纤维粘连蛋白（FN）均购自Promega公司。鼠抗人单克隆抗体MMP2、CD44V6及E-cad（即用型），超敏SP染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。
1.3 细胞黏附能力实验 采用机械法测定细胞黏附能力 ［1］ 。将96孔板预铺5μg LN和5μg FN的人工靶基质，37℃温育30min，以无钙镁的PBS液洗涤3次备用。将各组处理48h的细胞用无血清RPMI1640调整为5×10 4 /ml的细胞悬液，按100μl/孔加入细胞液，设对照组及各实验组，每组设立3个复孔。在37℃，5%CO 2 孵箱内孵育60min、90min后，倒置显微镜下计数细胞总数，弃去未黏附的细胞，PBS轻洗2次，镜下计数黏附细胞，计算黏附抑制率〔黏附抑制率=（对照组黏附细胞数-实验组黏附细胞数）/对照组总细胞数（含未黏附的细胞数）×100%〕。
1.4 免疫细胞化学法检测CD44V6、MMP2、E-cad蛋白的表达 收集对照组及各处理组培养48h后的细胞爬片，进行免疫细胞化学SP法检测CD44V6、MMP2、E-cad蛋白的表达情况（按试剂盒说明书操作）。结果判定:排除爬片边缘细胞，10×10低倍镜下随机选取10个细胞均匀分布的视野，10×20中倍镜下每个视野随机选30个细胞。按着色强弱分为4个等级:无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。按公式HSCORE=∑Pi（i+1）（i=0、1、2、3;Pi表示评分为i的比例）计算HSCORE得分 ［2］ 。该评分方法考虑到了单个细胞中蛋白表达是否阳性及其强弱，更具体真实地反映了细胞中蛋白总体表达的情况。MMP2主要表达于胞浆中，CD44V6表达于细胞膜上，E-cad在细胞膜和胞浆均有表达。
1.5 统计学方法 采用SPSS10.0软件进行统计分析。检测数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，与对照组比较采用t检验;各处理组间比较用单因素方差分析（ONEWAY ANO-VA）。P<0.05表示差异有显著性，P<0.01表示差异有非常显著性。
2 结果
2.1 As 2 O 3 、DDP对SKOV3细胞黏附能力的影响 药物处理48h后，可见处理组的黏附细胞数均明显减少，且具有浓度依赖性（P<0.05）。联合组黏附能力下降水平明显强于上述各单药组，差异均有非常显著性（P<0.01），提示两药联合具有更强的抑制肿瘤细胞黏附的能力。与60min结果相比，尽管90min时黏附细胞数增多，但细胞黏附抑制率却呈上升趋势，说明随时间延长，在没有处理因素存在的情况下，细胞的黏附能力仍难以恢复。见表1、2。
2.2 As 2 O 3 、DDP作用于SKOV3细胞48h后对E-cad、CD44V6及MMP2蛋白表达的影响 As 2 O 3 、DDP作用48h后，SKOV3细胞E-cad、CD44V6及MMP2的表达及HSCORE得分见表3。As 2 O 3 、DDP单用和合用均能下调CD44V6、MMP2表达，而As 2 O 3 还能同时上调E-cad蛋白表达。对细胞CD44V6表达下调，以联合组作用最显著（P<0.01）。
表1 As 2 O 3 、DDP对SKOV3细胞黏附能力的影响（略）
表2 As 2 O 3 、DDP对SKOV3细胞黏附能力的影响（略）注:表1、2中标有 △ 的各组间差异无显著性（P>0.05），余各组间均P<0.01
表3 SKOV3细胞E-cad、CD44V6及MMP2表达的阳性率（%略）注:各项 *、△ 之间， * 、 * 之间差异无显著性（P>0.05），余各组两两之间差异均有显著性（P<0.05）
3 讨论
肿瘤的侵袭及转移是肿瘤细胞与宿主细胞、细胞外基质之间一系列复杂的动态过程，是肿瘤患者治疗失败的主要原因;细胞黏附是肿瘤侵袭的基本条件，黏附过程贯穿于整个侵袭、转移过程中，肿瘤侵袭和转移的过程首先是肿瘤细胞黏附和去黏附的交替过程。因此，肿瘤细胞黏附能力改变就可能使肿瘤细胞侵袭、转移等恶性潜能下降，甚至阻断肿瘤细胞的远处转移，达到治疗肿瘤的目的。
本研究通过体外实验，采用机械法测定As 2 O 3 、DDP作用后SKOV3细胞黏附性改变，主要检测卵巢癌细胞对基质（FN、LN）的异质性黏附能力，方法简单、迅速、重复性好、结果可信。实验结果显示As 2 O 3 、DDP均可使卵巢癌细胞异质性黏附能力明显下降，以联合组效果最佳（P<0.05）;且随着时间的延长，黏附能力没有恢复迹象;提示As 2 O 3 、DDP具有明显抗细胞黏附的能力，且抑制作用具有不可逆性。
本实验选取与卵巢恶性肿瘤细胞黏附、转移关系密切的CD44V6、E-cad及MMP2来了解药物处理后其蛋白表达的变化，以期从分子水平上了解As 2 O 3 、DDP抑制SKOV3细胞黏附、转移的机制。
E-cad蛋白（即上皮性钙黏蛋白）是一种钙依赖性跨膜蛋白，是钙黏蛋白家族中的主要成员，其配体是自身同型细胞的钙黏蛋白，二者结合介导同质性黏附作用。E-cad蛋白既可以同种亲和方式保持细胞粘连，又能通过细胞骨架相互传递信号，其结构和功能变化直接影响肿瘤的脱落和再附着 ［3］ 。Sundfeldt等 ［4］ 研究发现E-cad蛋白表达减少能促进晚期卵巢癌的浸润和转移，被认为是一种重要的肿瘤转移抑制基因。本研究发现As 2 O 3 作用后细胞E-cad表达轻微上调，提示As 2 O 3 在抑制细胞异质性黏附的同时，可能还有促进癌细胞同型黏附的作用使癌细胞不易脱落，而DDP对E-cad表达无明显影响。
CD44是细胞与细胞、细胞与间质相互作用的最重要的黏附分子之一，能介导细胞迁移及肿瘤转移，被认为是肿瘤扩散转移的一种标志物。CD44V6是CD44的一种变异体，能促使肿瘤细胞与血管或淋巴管内皮细胞及ECM间的黏附，赋予肿瘤浸润生长和转移的能力 ［5］ 。本研究发现As 2 O 3 作用后，明显抑制了CD44V6表达;DDP组及联合组也能显著抑制CD44V6表达，以联合组抑制效果最显著。提示二者能通过下调CD44V6表达抑制卵巢癌细胞黏附、转移。
MMPs属于高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族，可降解基底膜和ECM的大多数蛋白质。MMP2（又称明胶酶A）是MMPs中的重要成员，其表达活性与肿瘤转移密切相关。研究表明MMP2可促使卵巢癌细胞发生腹腔播散，与上皮性卵巢癌侵袭、转移密切相关 ［6，7］ 。本研究结果显示As 2 O 3 作用后，MMP2表达出现轻微下降（P<0.05）;DDP及联合组也能使MMP2表达轻微下调。提示二者也能通过下调MMP2蛋白表达，降低肿瘤细胞的侵袭、转移能力。
As 2 O 3 、DDP单用和合用均能抑制SKOV3细胞与基质的黏附能力，两药合用抑制效果更明显，其抑制机制与二者下调CD44V6、MMP2表达有关，而As 2 O 3 还能同时上调E-cad蛋白表达使癌细胞不易脱落播散。表明As 2 O 3 对于预防和治疗以盆腹腔癌组织播散和种植为主的卵巢癌可能有重要的临床价值，二者联合运用对抑制肿瘤细胞的黏附、侵袭、转移等恶性生物学行为也有重要意义，值得进一步的体内实验来证实。
参考文献
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（编辑商志伟）
作者单位:637000四川南充川北医学院附属医院妇产科
400016重庆医科大学附属第一医院妇产科