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【摘要】
目的 本文采用常规PCR技术对40例宫颈鳞癌组织学标本和200例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ～Ⅱ级的宫颈分泌物标本的HPV16 DNA及p53基因5～6，7～8外显子变异进行了研究。
方法 采用常规PCR技术检测HPV16 DNA和p53基因及免疫组织化学方法检测p53基因。
结果 在40例宫颈鳞癌标本中HPV16 DNA阳性检出率有20例(50%)；200例CIN标本中有76例(38%)。p53基因在40例宫颈鳞癌标本中有20例出现变异(50%)，其中外显子5缺失10例(50%)，外显子6缺失1例(5%)，外显子7缺失3例(15%)，外显子8缺失6例(30%)。200例CIN标本均未检出p53外显子5～6，7～8的变异。宫颈鳞癌HPV16 DNA阳性与p53基因变异的符合率为80%。
结论 HPV16 DNA与宫颈鳞癌的发生有密切的相关性，p53基因在宫颈鳞癌组织中确实存在着变异。本研究认为常规PCR技术作为辅助诊断方法是一种快速、简单、适用于临床的方法。
关键词 宫颈鳞癌 宫颈上皮内瘤变 HPV16 DNA p53基因 PCR
The studies on HPV16 DNA and p53 gene aberrant in tissue of cervical squamous carcinoma and CIN
Ye Lianshun,Wan Ling
Chongqing Academy for Population and Family Planning,Chongqing 400020.
【Abstract】
Objective The study to the aberrance of HPV16 DNA and p53 gene exon 5～6,7～8 with routine PCR technology,which in 40 cervical squamous carcinoma histology sample and 200 Cervical intraepithelial neoplasia cervix dischange.
Methods Using routine PCR technology examed HPV16 DNA and p53 gene and using immuno-histochemical method examed p53 gene.
Results Indicated that HPV16 DNA's positive rates are 20(50%) in 40 cervical squamous carcinoma sample and 76(38%) in 200 CIN.p53 gene aberranted are 20(50%) in 40 cervical squamous carcinoma,thereinto,the absence was located on exon 5 was 10(50%),1(5%) was on exon 6,3(15%) was on exon 7,6(30%) was on exon 8.There is not aberrance of p53 exon absent in 200 CIN sample.The rate accord with the masculine of cervical squamous carcinoma HPV16 DNA and p53 gene's aberrance in cervical squamous carcinoma tissue.
Conclusion The study consideres that routine PCR technology is a speed,simple and apply means in the clinic assistant diagnose.
Key words cervical squamous carcinoma cervical intraepithelial neoplasia HPV16 DNA p53 gene PCR
宫颈癌的病因研究一直为国内外学者所重视，病毒病因的研究更是引人注目。随着分子生物学技术的不断发展，发现某些人乳头瘤病毒(HPV)型别与宫颈癌之间确有很强的相关性。伴随着研究的不断深入，癌基因的对立物—抑癌基因的研究也进入到一个新的发展时期，其中抑癌基因p53是研究热点之一。有研究认为50%的人类恶性肿瘤与p53基因相关，p53基因突变会导致细胞生长繁殖调控机能紊乱［1］。为探讨宫颈癌发生、发展与HPV16 DNA感染及抑癌基因p53之间的相关性，并探索适用于临床的检测方法，我们在细胞学、组织学、免疫组织化学的基础上，用常规PCR技术对比研究，以期寻求一种灵敏、快速、简单、能广泛用于临床的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料 200例根据子宫颈脱落细胞学TBS分类诊断为宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ～Ⅱ级的标本来源于我院附属医院门诊。40例宫颈癌标本是从本市内各大医院经组织学确诊为宫颈鳞癌的石蜡标本。
1.2 方法 采用常规PCR技术检测HPV16 DNA和p53基因及免疫组织化学方法检测p53基因。
宫颈分泌物DNA的提取采用高压灭菌棉拭子取宫颈表面及宫颈管的分泌物，将拭子放入盛有1ml去离子水的反应管(Eppendaff管)内振荡，冲洗收集子宫颈脱落细胞于水中，再将含有宫颈脱落细胞的Eppendaff管置于100℃水中煮沸15min使其变性后，10000r/min超速离心15min，上清液作为模板DNA进行PCR技术HPV16 DNA和p53的检测分析。
宫颈癌组织石蜡标本DNA提取15μm组织切片，常规脱蜡至水，经裂解液及蛋白酶K消化后，常规酚氯法提取DNA［2］，上清液做模板待测。
HPV寡聚核苷酸引物由华美公司提供专用于科研的HPV-16引物，含有20个碱基对，选择基因6区(E6)扩增片段长度230～270bp。基因扩增Eppendaff管内反应体系中含DNA模板4μl，Taq酶2μl，用去离子水调整总体积至50μl反应混合物，同时设不加模板的阴性对照和加入阳性物模板的阳性对照，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s。共35个循环周期，72℃终延伸5min，然后取反应产物15μl放入含有溴化乙锭的1.5%～2%琼脂糖凝胶中电泳(电压50mV)，紫外光透射下观察。如标本在230～270bp处出现条带为HPV-16(E6)阳性。p53基因5～6，7～8外显子引物由北方同正公司提供。模板DNA 5μl加入PCR反应管内，在基因扩增仪上进行94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s，共35个循环，同时用正常人白细胞DNA模板作为正常对照组。10μl扩增产物进行2.5%琼脂凝胶电泳60min(电压40mV)，紫外光透射下观察，进行结果判断。若每次电泳的样本与正常对照带相比出现条带的增多、减少或位置变动即说明该样品存在基因突变或缺失。
宫颈癌组织p53免疫组化检测，载玻片选择APES法进行防脱片处理，切片经常规脱蜡，梯度酒精脱水，3%H2O2室温10min灭活内源性酶，蒸馏水洗2min共3次，切片侵入0.01M、pH 6.0枸橼酸盐缓冲液中，加热至100℃ 30min，冷却后滴加抗原修复液，室温放置10min，蒸馏水洗2min，共3次，滴加封闭液，室温放置10min，甩去多余液体，不洗，滴加抗p53蛋白的抗体，4℃过夜。0.01M PBS液洗2min，共3次，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20℃～37℃ 20min，0.01 MPBS洗2min共3次，滴加试剂SABC，37℃ 20min，0.01M PBS洗5min共4次，DAB显色剂显色，蒸馏水洗涤，苏木精复染，脱水透明，封片，光镜下观察，阳性细胞核着色呈棕黄色。
2 结果
(1)200例宫颈分泌物标本检测出HPV16 DNA阳性76例，阳性率38%，未测出p53基因5～6，7～8外显子变异。(2)40例宫颈癌标本中检测出HPV16 DNA阳性20例－阳性率50%。p53基因缺失分别为外显子5缺失10例(25%)，外显子6缺失1例(2.5%)，外显子7缺失3例(75%)，外显子8缺失6例(15%)。(3)40例宫颈癌标本p53基因免疫组化染色显示友15例大部分细胞核着棕黄色，阳性率37.5%。
3 讨论
子宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤，据估计可占到整个妇女癌症的10%。每年全世界约有10万人死于子宫颈癌，其中3/4以上的死亡发生在发展中国家，而在西方工业化国家对于所有恶性肿瘤疾病的公共预防措施中，子宫颈癌也许是做得最好的。在过去50年中，由于细胞学技术广泛应用于早期筛查，将子宫颈癌的发病率降低了3/4。随着近年来对某些高危型HPV感染和子宫肿瘤关联的抑癌基因的了解，人们开始对检测和预防CIN和子宫颈癌有了新的认识。从而使HPV寡核苷酸和p53抑癌基因的检测方法有可能成为一种非常有用的癌症早期筛查方法得到重视，它可以单独使用，和细胞学结合使用会提高其诊断效果。
不少学者报道，分子流行病学表明某些特定的HPV是浸润性子宫颈癌和子宫颈上皮内瘤变的主要致病原因。目前已鉴定出80余种HPV，认为其中40种可以感染生殖道，而且公认HPV16 DNA-E6是所有国家宫颈癌中最常见的类型，占58.9%，HPV18为第2位［3～6］。1995年国际癌症研究协会(IARC)根据4个病例对照研究获得充分的证据，把HPV16 DNA和18型作为人致癌微生物［7］。而HPV不能在体外培养，检测需严格地依赖对其DNA序列的分子水平检查，因此，目的核酸扩增PCR这一技术给HPV检测提供了巨大的发展空间［8］。有人在癌标本中检出HPV16 DNA、HPV18 DNA的阳性率分别为38%、32%。而非癌组织中仅为13.2%、17.5%。宫颈鳞癌主要与16型E6基因相关，腺癌以18型为主。16型在浸润性癌中检出率达50%，原位癌仅10%，认为16型涉及晚期癌。亦有学者认为亚临床或潜伏期阳性率约50%。随着病变程度的进展，检出率呈上升趋势。由CINⅠ的25%上升到CINⅢ的46.2%，宫颈浸润癌中达90%以上［9］。HPV16 DNA侵入宿主细胞后，DNA整合到宿主细胞核的基因组中，激活了调节病毒生长的E6、E7基因片段，使之无限制地转录，导致了上皮层内鳞状细胞的恶变［10］。本研究在临床细胞学诊断为CIN Ⅰ～Ⅱ的患者中HPV16 DNA检出率为38%，组织学诊断为宫颈鳞癌的标本中检出率为50%，与报道基本一致。
p53基因结构和表达异常是迄今人类肿瘤中最常见的基因改变之一，已在多种肿瘤中发现［11］。特别是野生型p53基因在维持细胞正常生长，抑制恶性增殖过程中起重要作用。若p53丢失、突变或与病毒蛋白结合而失活，均可导致恶性细胞的生长引发肿瘤。突变的p53不仅失去了正常野生型p53的生长抑制作用，而且本身又具有癌基因的功能，鉴于p53与肿瘤发生、发展的密切关系，人们希望将p53最终用于临床，作为肿瘤诊断的辅助诊断。传统的观念认为p53基因的改变常出现在肿瘤的晚期阶段，但近年来不少研究表明某些肿瘤在异型增生这一早期即可有p53突变［12］，因此，p53基因的异常在肿瘤早期诊断中究竟有无作用，目前尚不可完全定论。本研究在CINⅠ～Ⅱ的标本中尚未检测到p53突变基因的丢失、突变等。那么在CINⅢ或原位癌的病变中能否测到p53基因的改变是值得探讨的方向。
有人用免疫组化的方法在乳癌标本中检测到p53的表达，发现p53蛋白过度表达的肿瘤与病理分期密切相关，其术后复发间期短，患者存活率低，提出能否将此作为临床判断预后和帮助医生制定术后治疗方案的指标之一［12］。也有研究在肺癌组织中用免疫组化方法，检测到p53蛋白总阳性率为50.5%，而用PCR-SSCP检测p53基因突变率为41.1%(外显子5为38.5%，外显子6为7.7%，外显子7为33.3%，外显子8为20.5%)。证实两种方法符合率为779%［13］。而本研究在子宫颈癌标本中用免疫组化方法测到p53蛋白阳性率为37.5%，PCR技术测出p53基因缺失率为50%(外显子5为25%，外显子6为2.5%，外显子7为75%，外显子8为15%)，两种方法符合率为75%，所以认为免疫组化法是值得完善的一种方法。
Werness等的体外实验证实HPV16 DNA-E6、E7癌蛋白可分别与肿瘤抑制基因产物p53蛋白结合，HPV16 DNA-E6蛋白和p53蛋白的相互作用被认为是HPV16 DNA引起细胞转化的可能机制之一［14，15］。发现HPV16 DNA-E6蛋白能与p53蛋白结合形成复合物，其过程需要一种额外细胞因素的参加，这种细胞因子就是E6相关蛋白。Masami等对36例人宫颈标本中p53基因5～8外显子的检测发现其突变率仅为5%，且与HPV无关。但这不能排除p53在mRNA水平上有无改变。这或许涉及到其他尚未确定的肿瘤抑制基因［16，17］。亦有研究发现在HPV DNA阳性的宫颈癌中HPV16 DNA-E6、E7蛋白与Wt p53蛋白结合，而在HPV DNA阴性的宫颈癌则表现为p53基因的错义突变，认为HPV并不直接作用于p53基因，而是通过其蛋白如HPV16 DNA-E6、E7与Wt p53蛋白结合发挥致癌作用。
还有研究者用谷胱甘肽S转移酶(GST)融合蛋白，发现HPV16 E6与Wt p53具有高度亲和性，很容易结合形成复合物，从而致使Wt p53蛋白不能与DNA上特殊位点相结合，妨碍了其作为转录因子的作用。
慢性宫颈炎无p53 5～6，7～8，9外显子的变异，说明该病的发生、发展与p53变异无关。而宫颈癌p53变异率2286%，集中在外显子5～6、7～8，变异率分别为5.71%、1429%，说明变异发生的多位点性，提示p53变异的复杂性［18］。因此，本研究认为对慢性宫颈炎患者，定期的细胞学检查是必要的，CINⅠ级以上有应做HPV16 DNA-E6和p53基因的检测。
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作者单位： 400020 重庆市人口和计划生育科学技术研究院
(编辑 乔 晓)