HPV检测与宫颈相关病变的诊治进展

    宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤之一，发病率居女性肿瘤的第二位。每年约有371 200例新发病例，其中80%在发展中国家。我国宫颈癌的发生率和死亡率约占全世界的1/3。现已明确人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌的根本致病因素，其中高危型HPV（HRHPV）与宫颈癌的相关性比吸烟与肺癌还要高，它可引起95%以上的宫颈癌［1］。HRHPV持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生、发展的必要条件。

    1  宫颈癌与HRHPV的相关性

　　Andersson等［2］报道HRHPV在CINⅠ、CINⅡ和CINⅢ中的检出率分别是36%、63%和83%，其中以HPV16最常见。研究显示，HRHPV对CINⅡ/CINⅢ的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为96.3%、60.2%、20.6%和99.3%，说明HRHPV阳性明显预示CINⅡ/CINⅢ的存在或将来有可能发展为CINⅡ/CINⅢ；当细胞学检查由异常转为正常时，HRHPV感染也会消失，此种细胞学转变时间比HRHPV转阴平均晚0.3年。此外，使用杂交捕获或PCR方法检测HPV DNA通常具有97%～100%的阴性预测值。较高的阴性预测值意味着，如果HPV DNA为阴性，几乎没有患病的可能。这对宫颈疾病的初筛、ASCUS分流及治疗追踪都具有重要意义。Sherman等［3］追踪20 000例女性达45个月以上，在HPV阳性/宫颈涂片为ASCUS或更高的女性中，CINⅢ或宫颈癌的累积发生率是4.54%，而在HPV阴性并具有正常细胞学的女性中，发生率仅为0.16%。因此，对于年龄超过30岁、高危型HPV DNA阴性的女性，其宫颈筛查间隔期可相对延长，因其宫颈癌发生风险在5～8年中可忽略不计。若HPV DNA与细胞学结果均为阴性，则可保证她们在更长时间内减少发生宫颈癌的风险。总之，HPV检测不仅提高宫颈细胞学筛查的敏感性，预警细胞学正常或ASCUS患者的病情发展，还能延长HPV阴性而细胞学异常女性的检查间隔期。此外，HPV还可预测宫颈相关手术后有无残留，评估疗效及预后。HPV持续存在是宫颈疾病复发和演进的重要因素。虽然宫颈细胞学检查使宫颈癌的发病率和死亡率大幅下降，但细胞学诊断易受主观因素影响，水平参差不齐。因此，HPV检测已成为宫颈的另一种重要防癌筛查手段，无论单独进行，还是与细胞学配伍，在宫颈癌的防治工作中均占有主导地位。

    2  HPV不同检测方法的比较

    2.1  核酸分子杂交法

    2.1.1  HPV DNA第二代杂交捕获试验（HCⅡ）  2003年，由美国食物药品管理局（FDA）批准，认为它是30岁或30岁以上女性宫颈细胞学筛查的辅助方法。HCⅡ采用96微孔板，内含阳性和阴性控制，使用高危和低危型核糖核酸探针，能检测13种HRHPV和5种低危型HPV，是一种易于操作的液基杂交检测方法。HCⅡ使用的RNA探针能与HPV DNA互补，产生HPV DNARNA杂交产物，杂交产物被固定在捕获微孔板上的抗体所捕获，经过一系列反应产生发光产物，发光的密度与标本中靶DNA形成一定比例，以此测量病毒负荷半量。被推荐的阳性诊断阈值是1.0 RLUs（即1 ml样本缓冲液中有1 pg HPV DNA，相当于每个试验孔中有5900条染色体）。此法的缺点是不能对HPV分型，当任何一种型别的HPV DNA超过阈值，其检测结果均为阳性。此外，高危型探针还可与其他型别HPV交叉反应，例如53、66、67和73，产生假阳性结果，降低试验特异性，但也提高了试验的敏感性。Kiatpongsan等［4］报道HCⅡ对HSIL的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为85.7%、69.7%、34.3%和96.4%，应用其高敏感的阴性预测值可在ASCUS中排除HSIL病变。因此HCⅡ是一个可信赖的方法。

    2.1.2  原位杂交法  使用放射性或非放射性DNA或RNA探针标记细胞或组织，优点是能够定位，适合HPV相关的细胞和病理学研究，假阳性率低，但灵敏性不高。研究报道，应用原位杂交，在LSIL中HPV DNA检出率为95%，HSIL为70%，浸润癌为40%～50%。与PCR法相比，原位杂交在LSIL中具有与PCR相同的HPV灵敏性，但对病毒复制较少的宫颈癌，灵敏性则相对较低，而PCR法的HPV检出率接近100%。

    2.1.3  Southern杂交法  主要应用酚氯仿提取纯化DNA，通过限制酶消化、电泳、变性、转膜和放射性标记探针杂交鉴定HPV亚型。此法是以杂交片段大小与杂交的严格性为基础，灵敏度与HCⅡ类似，但也具有耗费人力、试验步骤复杂和使用放射性探针等缺点。

    2.2  PCR法  灵敏性最高，只要标本中HPV基因有10～100copies/μl即可检出，并能对HPV分型。Maaike等［5］对539例女性施以PCR为基础的HPV检测，结果证实它是一种敏感的、特异的HPV检测方法。但PCR法的缺点是灵敏性高，易导致交叉污染，而出现假阳性结果。

    2.2.1  通用引物PCR（GPPCR）  迄今已发现HPV有120多种分型，如针对不同分型HPV特异序列，合成特异性引物进行PCR反应，则工作量大，消耗多。为避免此弊端，可依据HPV各型具有高度保守的L1序列合成通用引物，包括MY09/11、PGMY09/11、GP5+/6+和SPF1/2。GPPCR具有广谱优势，阳性率高于特异引物PCR，能检测到40多种不同类型HPV，是使用最广泛的实验程序，便于临床大规模筛查和流行病调查。此外，该法既可检出HPV已知序列，又可检出未知序列，结合直接测序法不仅能对HPV DNA分型，还可发现HPV少见和变异类型。

    2.2.2  反转录PCR（RTPCR）  采用的检测靶物是mRNA，能从转录水平分析基因表达是否正常。mRNA检测灵敏度比DNA高。Lie等［6］对383例细胞学异常的挪威女性进行HPV DNA（HCⅡ）和HPVmRNA检测，显示所有宫颈浸润癌mRNA均为阳性，mRNA能更准确地评估宫颈癌风险。此外，RTPCR还能可靠区分转移性宫颈癌、新的宫颈原发癌和另一个癌的转移灶，这是组织学难以区分的。近来已有采用抗HPV 16、18癌蛋白疫苗，有效治疗转移性宫颈癌的报道，而已知卵巢、肺、子宫内膜的肿瘤与HPV无关，对其新原发肿瘤或转移癌行HPV疫苗治疗是无效的。因此，RTPCR检测宫颈mRNA对应用疫苗治疗具有指导意义。

    2.2.3  荧光定量PCR（FQPCR）  在常规PCR基础上把基因扩增、分子杂交和光化学融为一体，使PCR扩增和产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结果自动分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。此法通过探针杂交进一步提高了HPV DNA检测的特异性，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临床工作和大规模筛查。但该技术主要针对HPV6、11、16和18感染，易漏诊其他HPV亚型。

    2.3  基因芯片技术  将大量寡核苷酸或cDNA作为探针固定于固相支持物上，借助碱基互补，与经PCR或RTPCR扩增、分别以Cy3、Cy5标记的样本靶分子进行杂交，经激光共聚焦扫描仪检出杂交信号强度，通过计算机分析获得信息，基因芯片可对HPV进行分型［7］，并能同时检测多种HPV亚型，是检测HPV多重感染的有效方法［8］，真正实现了基因分析所具备的大规模、并行性、高效、自动化特点。尽管如此，该技术尚存一些亟待解决的问题，如：有效合成芯片探针，提高芯片的特异性及增加信号检测灵敏度等。

    2.4  免疫组织化学法  利用抗原抗体反应和组织化学原理，在石蜡或冰冻切片的组织和细胞中原位显示抗原成分，操作简便，可作回顾性研究。此法只能确定细胞核的HPV衣壳蛋白，且需要足够量病毒颗粒才有阳性反应，阳性率在30%～60%，而PCR法阳性率一般在70%～93%，且石蜡包埋组织可增加HPV假阴性结果，如果新鲜组织通过PCR技术检测，HPV的患病率将会提高。因此，免疫组化法的敏感性及特异性比原位杂交和PCR要低。

    2.5  血清学检测  HPV L1表面存在多肽18283和18284，资料显示抗18283和18284抗体识别CIN和宫颈癌的敏感性为92%～97%，特异性为89%～95%［9］。此抗体能区别正常与具有宫颈病变的女性，有望成为宫颈癌筛查的工具，但仍需大样本进一步研究。此外，Digene公司研制了快速批量试剂盒，检测HPV DNA，每批10～100人，耗时2 h，Arbor Vita公司也研制了试纸条，快速检测HPV蛋白质，仅需15 min。还有一些新的高度宫颈病变的生物标记法也在发展，如p16（INK4A），它具有识别HRHPV DNA阳性并患有高度宫颈病变的女性的潜力。相信将来会出现简便、高效、低廉的检测方法，推进宫颈癌防治工作的发展。

    3  已感染HPV的CIN患者治疗方法探讨

　　虽然针对HPV感染CIN患者的治疗，已从传统的物理疗法发展到HPV疫苗的研究，但目前尚无彻底清除HPV的有效方法。如何选择高效、合理、规范化的治疗是当今亟待解决、又存争议的问题。

    3.1  药物治疗  保妇康栓是临床局部常用药物，以中药莪术油为主要成分，具有抗肿瘤、增强免疫、抗菌及抗病毒作用。实验表明，它能使HPV E6、E7 mRNA表达降低，抑制SiHa细胞DNA合成复制，它不仅有抗游离型病毒感染的能力，而且对整合于宿主细胞染色体上的病毒基因片段也有抑制作用。此外，广谱抗病毒药物如利巴韦林，通过阻止DNA和RNA复制，增加机体免疫，对HPV感染的CIN患者也具有一定的治疗作用。

    3.2  局部物理及手术治疗  包括激光、冷冻、冷刀和LEEP刀等，安全有效。AschkenaziSteinberg等［10］报道HPV感染CIN患者经LEEP刀治疗后，平均HPV转阴时间比期待疗法组明显缩短（分别为7.7个月和19.4个月），两组第1年HPV转阴率分别为65%和23%，第2年转阴率为90%和65%，均有明显差异。关于影响治疗效果的因素，Molano等［11］发现HRHPV16、18比低危型HPV有明显低的清除率。Cricca等［12］对HPV16阳性的HSIL患者行宫颈锥切术，发现HPV清除率与术前HPV DNA的生物状态以及是否给予抗病毒治疗无关，而与切缘是否存在病变有关。另外，Song等［13］对67例HRHPV感染的CIN2或CIN3患者行宫颈锥切术，切缘均无病变，HRHPV感染的有效清除率为82.1%，而那些术后HRHPV持续存在的患者，术前均具有较高的病毒负荷，此类患者术后应密切随访。此外，年龄大于50岁的患者具有更高的感染复发风险。由此可见，物理及手术治疗效果与年龄、HPV亚型、切缘是否存在病变以及术前HPV负荷量等密切相关，这些因素对二线治疗及随访安排至关重要。特别强调，有效治疗标准应该是切除病变的同时清除HPV感染，患者病情轻重不能成为治疗周期长短的决定因素，HPV DNA才是监测治疗有效性的中间结束点。如治疗后HPV持续阳性，需延长随诊时间，通常CIN复发在治疗后2.5年之内。Hogewonign等［14］建议随诊期应用避孕套可减少性伴侣间HPV的重复感染，促进CIN转归及HPV的清除。

    3.3  免疫治疗  代表药物为干扰素，能增强人体细胞免疫、体液免疫以及各种非特异因子组成的防御系统，并能阻止病毒RNA的转录和翻译，抑制病毒蛋白的合成，具有抗病毒、抗增殖及免疫调节作用，是目前公认的抗病毒活性药物。干扰素不直接对抗HPV，而是通过诱发体内免疫系统清除HPV，不针对某种HPV亚型，但对各亚型均有抗病毒作用。临床常用药物奥平栓以重组人INFα2a为主要成分，安达芬栓以重组人INFα2b为主要成分。此外，Sikorski等［15］和Cazorla等［16］报道INFβ、INFγ可使HPV相关性宫颈疾病消退。在CIN的治疗中有较好的长期疗效。INFω是一种新型干扰素，有望用于多种肿瘤和病毒性疾病的治疗，尤其适用于对IFNα耐药的患者。

    3.4  HPV疫苗  包括预防性和治疗性两种疫苗。预防性疫苗主要诱导体液免疫，产生中和性抗体，在HPV进入机体前即能与病毒抗原结合，防止HPV感染。治疗性疫苗主要引起细胞免疫，产生活化免疫细胞识别、攻击HPV感染的组织，包括HPV引起的恶性肿瘤组织。预防性疫苗基于HPV L1病毒样颗粒（VLPs），VLP在形态上与HPV完全一样，但不含病毒DNA。Villa等［17］277例年轻女性应用四价HPV（6、11、16、18）VLP疫苗，36个月后发现HPV持续感染率、CIN、宫颈癌或外生殖疣的发生率下降了90%。研究显示，预防性疫苗具有满意的免疫原性和耐受，能诱发高血清抗体滴度，且副作用最小，可有效地预防宫颈高度病变的发生。尽管此疫苗主要针对HPV6、11、16、18，但对其他一些亚型感染也有交叉预防作用。目前该疫苗的使用策略定位于第一次性生活前，即暴露于HPV感染风险前的年轻女性（11～13岁）。治疗性疫苗主要针对HRHPV E6、E7蛋白，它们是公认的转化蛋白，在CIN和宫颈癌组织中表达较高，已成为研究最多的靶抗原。治疗性疫苗主要包括肽类疫苗、嵌合型病毒样颗粒、DNA重组疫苗、DNA疫苗及基于细胞的疫苗等。Garciahernandez等［18］报道应用治疗性疫苗能有效地刺激免疫系统对HPV的反应，并能使HSIL消退转归。值得一提的是，尽管动物实验及部分临床前期实验中HPV疫苗显示有效，但许多问题有待解决，如疫苗的保护间隔期等。可以预言全球范围内，预防及治疗性HPV疫苗的应用不远的未来将成为可能。

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作者单位：100853 北京，解放军总医院妇产科