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【关键词】 卵胞浆
自1992年卵胞浆内单精子注射（ICSI）［1］问世以来，实现了男性少、弱，畸形精子症患者获得遗传学后代的愿望，1993年Schoysman等［2］报道了无精子症患者应用睾丸精子行ICSI获得成功。此后，经皮附睾抽吸（PESA）、睾丸切开（TESE）行ICSI已作为有正常生精的梗阻性无精（OA）或睾丸衰竭的非梗阻性无精（NOA）及不射精患者常规治疗方法。临床上，无精子症患者在排除遗传性疾病的基础上一般首先要进行附睾或睾丸的诊断性活检，其参数可预测附睾或睾丸内是否有精子。为了避免在其后的ICSI周期中反复的睾丸手术造成的血行阻断和可能的永久性损害，可以将前期诊断性睾丸活检获取的精子或ICSI治疗周期所剩余的微量活精子进行冷冻保存，然后择期行ICSI治疗。本研究回顾性分析了本中心进行的冷冻附睾或睾丸精子复苏后行ICSI治疗的有效性，并与新鲜睾丸精子相比较。
1资料与方法
1.1一般资料回顾性分析了2007年9月~2008年1月应用冷冻复苏后的附睾、睾丸精子行ICSI 5个周期（4PESA，1TESE），新鲜附睾、睾丸精子行ICSI 41个周期（27PESA，14TESE），共46个周期。46对男性梗阻性无精的不育夫妇中2例为不射精，11例为先天性输精管缺如，6例为附睾结核，1例先天性右侧输精管缺如伴左侧隐睾，其余均为原因不明的无精子症。确定无精至少需3次射出的精液标本离心处理并检测沉淀。
1.2卵巢刺激给予长效促性腺激素释放激素类似物（GnRH-a）抑制垂体，重组促性腺激素（FSH）刺激卵巢，诱导多个卵泡生长，B超监测卵泡发育情况，当至少有2个优势卵泡直径达到17 mm后，停用GnRH-a 和FSH；予以绒毛膜促性腺激素（HCG）5000~10000 IU肌注后32～36 h后，在B超引导下经阴道穹隆穿刺取卵。去除卵冠丘复合物外的颗粒细胞，MⅡ期成熟卵子待行ICSI。
1.3精子的获取PESA：局部麻醉下，患者采取仰卧位，常规消毒，铺巾，将附睾固定于阴囊皮下，用已预先抽进少量培养液的1 ml BD注射器于肉眼直视下穿刺附睾头并负压抽吸，直至针管内有淡黄色混浊附睾液体抽出。如未见液体抽出，则改变穿刺点。将附睾液注入培养皿，在倒置显微镜下寻找活动精子。如镜下未见活动精子，则再次穿刺取精或行对侧附睾穿刺，若仍无精子，则考虑TESE法取精。TESE：局部麻醉下，在阴囊皮肤做一个小切口，穿过腹膜鞘膜在白膜上做一个或多个小切口，切取一块睾丸组织放入1006培养液（美国 Quinns产品）中，室温下保持15 min，洗涤2次，在解剖显微镜下用两个无菌BD注射器将睾丸组织撕碎，在倒置显微镜下检验一滴悬液，检测有无精子。
1.4精子悬液的制备和冷冻检测到活动精子的附睾悬液或睾丸组织悬液，加入到含3 ml 1006培养液Falcon试管中，2次离心（600 g，5 min），弃上清，加入0.1 ml 1006培养液，稀释混匀。放入37 ℃ 5.5%CO2培养箱内孵育（注意紧盖），待行ICSI。如ICSI后所剩余精子数目足以再行ICSI，则将剩余精子加以冷冻；诊断性活检则将精子2次离心洗涤处理后直接冷冻。将精子冷冻保护液8020（美国 Quinns产品）和精子悬液按体积1∶1比例混匀，分装入冷冻管中，在液氮气相中暴露15 min，最后投入液氮冷冻保存。
1.5冷冻精子复苏和ICSI取卵日有成熟卵子即可复苏附睾或睾丸冷冻精子，从液氮中取出冷冻管，迅速将其投入37 ℃水浴中5 min，后用1006培养液离心洗涤2次（600 g，5 min），沉淀用0.1 ml 1006培养液混匀，放入37 ℃ 5.5%CO2培养箱内孵育1 h（注意紧盖），在倒置显微镜下检验一滴复苏的悬液，检测有无活动精子。有活动精子在取卵后4 h行ICSI。
1.6受精、胚胎评估和胚胎移植ICSI后18 h观察受精，正常受精可观察到双原核和两个清晰或碎裂的极体，后24 h、48 h观察胚胎分裂情况，取卵后第3天选择优质胚胎移植，移植后14天检测HCG，如阳性，则为生化妊娠，再于移植后35天测血β-HCG升高，B超检查显示妊娠囊、见胎心搏动则为临床妊娠。
1.7统计学方法采用SPSS软件对数据进行统计学分析，计量资料用t检验，计数资料用χ2检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。
2结果
回顾性分析了46对男性梗阻性无精的不育夫妇，共46个促排卵周期，行冷冻复附睾或睾丸精子ICSI 5个周期（4PESA，1TESE），行新鲜附睾或睾丸精子ICSI 41个周期（27PESA，14TESE）。冻精组男性平均年龄为（32.2±5.2）岁，女性平均年龄为（30.0±5.0）岁；对照组男性平均年龄为（32.5±5.4）岁，女性平均年龄为（30.0±5.3）岁。见表1。对比两组ICSI的受精率、卵裂率和优胚率，未显示有统计学差异（P>0.05）。冻精组共移植5个周期，妊娠4例，继续妊娠3例，宫外孕1例；对照组共移植39个周期，放弃移植2个周期（1个为未卵裂，1个为患者有OHSS高风险），妊娠17例，继续妊娠15例，流产2例。冻精组临床妊娠率和胚胎种植率明显高于对照组，但差异亦无统计学意义（P>0.05），见表2。表1冻精组、对照组患者的一般情况表2冻精组、对照组的ICSI参数和临床结局
3讨论
新鲜附睾或睾丸精子行 ICSI被广泛地应用于无精子症患者，使更多的无精子症患者拥有了自己的遗传学后代。然而这项技术主要缺点之一就是每一次ICSI操作都需要外科手术取精，大部分的不孕夫妇仍需行多个取卵和ICSI周期才会受孕，这不仅给患者带来麻烦，还会损害附睾和睾丸［3］。为了解决这个问题，近些年来，诊断性活检时冷冻附睾或睾丸精子后复苏行ICSI逐渐应用于临床，而且取得了与新鲜附睾或睾丸精子ICSI周期相近的临床结果［4，5］。我们是2007年7月初探PESA精子冷冻，8月初探TESE精子冷冻，并于2007年9月获得第1例TESE精子冷冻复苏后ICSI的临床妊娠，2007年10月获得第1例PESA精子冷冻复苏后ICSI的临床妊娠。本资料回顾性分析了诊断性附睾或睾丸活检冷冻精子复苏后行ICSI治疗的有效性及妊娠结局，结果显示冷冻复苏的附睾或睾丸精子行ICSI所得受精率、卵裂率、优质胚胎率、妊娠率和种植率与使用新鲜附睾或睾丸精子行ICSI相比没有统计学差异（P＞0.05），这与Gianaroli 等［6］报道一致。尽管有报道证实［7］，附睾或睾丸精子的冷冻复苏会对精子造成胞浆空泡增多，细胞核和胞质膜皱缩或水肿、膜断裂、顶体等损害，但冷冻也间接起到了一种筛选的作用，清除了大部分有缺陷的精子，只有那些活动力较好、膜功能稳定、代谢旺盛、染色体正常的精子才能经受住低温而得以保全，这种选择，解释了本研究冻精组临床妊娠率和种植率高于对照组的结果，但本研究也与一些文献报道相反［8］，考虑是否与样本较少有关，还需增大样本来进一步证实。冷冻并没有降低精子的发育潜能，使用冷冻附睾或睾丸精子ICSI的结果是可以接受的。ICSI治疗周期前行诊断性睾丸活检并冻存附睾或睾丸精子是可行和有效的，一方面增加了新鲜睾丸组织的利用率，最大限度地保留了患者的遗传物质［9，10］，另一方面也减轻了反复外科手术取精给患者带来的精神和经济负担，有效地防止了在取卵当日因外科手术取精失败而放弃本周期治疗的发生。
【参考文献】
1Palermo G，Joris H，Devroey P，et al.Pregnancy after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyte.Lancet，1992，304:17-18.
2Schoysman R，Vanderzwalmen P，Nijs M，et al.Pregnancy after fertilization with human testicular spermatozoa.Lancet，1993，342:1237.
3Schlegel PN，Su LM.Physiological consequences of testicular sperm extraction.Hum Reprod，1997，12:1688-1692.
4Cayan S，Lee D，Conaghan C，et al.A comparison of ICSI outcomes with fresh and cryopresened epididymal spermatozoa from the same couples.Hum Reprod，2001，16 （3）:495-499.
5Gil-Salom M，Romero J，Minguez Y，et al.Pregnancies after intracytoplasmic sperm injection with cryopreserved testicular spermatozoa.Hum Reprod，1996，11:1309-1313.
6Gianaroli L，Magli MC，Selman HA，et al.Diagnostic testicular biopsy and cryoproservation of testicular tissue as an alternative to repeated surgical openings in the treatment of azoospermic men.Hum Reprod，1999，14（4）：1034-1038.
7Nogueira D，Bourgain C，Verheyen G，et al.Light and electron microscopic of human testicular spermatozoa and spermatids from frozen and thawed testicular biopsies.Hum Reprod，1999，14（8）:2041-2049.
8Vernaeve V，Tourmaye H，Osmanagaoglu K，et al.Intracytoplasmic sperm injection with testicular spermatozoa is less successfulin men with nonobstructive azoospermia than in men with obstructive azoospermia.Fertil Steril，2003，79：529-533.
9Oates RD，Lobel SM，Harris D，et al.Efficacy of intracytoplasmic sperm injection using intentionally cryopreserved epididymal sperm.Hum Reprod，1996，11:133-138.
10Oates RD，Mulhall J，Burgess C，et al.Fertilization and pregnancy using intentionally cryopreserved testicular tissue as the sperm source for intracytoplasmic sperm injection in 10 men with non azoospermia.Hum Reprod，1997，12:734-739.
作者单位：110005 辽宁沈阳，沈阳东方医疗集团菁华医院生殖实验室