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【摘要】 目的动态观察早产大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)在发育阶段促红细胞生成素受体(erythropoietin receptor,EPOR)表达的变化。方法将SD大鼠孕鼠于孕18、20d时行割宫产取出胎鼠，分离纯化AECⅡ，另取足月产(22d)新生鼠分离纯化AECⅡ作为对照。分离的AECⅡ按孕龄18、20、22d分为三组培养在37℃，5%CO2培养箱中。PT-PCR及Western blot法检测肺组织EPOR基因和蛋白表达。结果EPOR mRNA在孕22d表达最强，在孕20d和孕18d时表达逐渐减弱。在孕18、20及22d时，EPOR蛋白平均光密度值分别为1.21±0.02、1.42±0.04、1.82±0.03，其表达随孕龄增加而逐渐增强。结论早产大鼠肺损伤可能与EPOR表达较低有关。
【关键词】 促红细胞生成素受体;肺发育;肺泡Ⅱ型上皮细胞
ObjectiveTo observe the dynamic changes of erythropoietin receptor (EPOR) in typeⅡ alveolar epithelial cells (AEC II) in premature delivery rat.MethodsFetal rats were cut from uterus at Day 18,Day 20 and Day 22 of gestation. The AEC II were separated from fetal lung and divided into three groups(18d,20d,22d) according to gestational age .PT-PCR and Western blot assay were used to detect the expression of EPOR.ResultsExpression of EPOR mRNA on 22d was the strongest and expression on 20d or18d weakened. On 18d,20d and 22d,the average optical density values of EPOR protein were:1.21±0.02,1.42±0.04,1.82±0.03.Expression of EPOR increased with gestational age.ConclusionLung injury in premature rat may be associated with the expression of EPOR weakening.
[Key words]erythropoietin receptor ;lung development;typeⅡ alveolar epithelial cells
早产约占分娩总数的5%～15%,75%以上围生儿死亡与早产有关。早产儿死亡的主要原因是胎儿肺发育不成熟并发新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)。因此，促进胎儿、早产儿肺成熟成为降低围生儿发病率和死亡率的关键[1]。吸入高浓度氧气是导致新生早产儿肺发育障碍,并最终发展为慢性肺疾病(CLD)的主要原因[2],但肺损伤发病机制还不清楚。深入研究早产儿肺损伤的发生机制和防治措施，对提高早产儿存活率和生存质量具有重要意义。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial cell Ⅱ,AECⅡ) 是肺损伤修复的主要干细胞，对肺泡壁重新上皮化以恢复气血屏障起重要作用。在早产儿肺损伤中，AECⅡ居于肺发育受阻及损伤修复的中心位置[3]。促红细胞生成素受体(EPOR)是造血细胞因子受体超家族中的一员，近年来研究[4]发现，EPOR不仅存在于红系干细胞，AECⅡ细胞也表达EPOR，该受体是细胞减少凋亡的重要保护性受体。本研究将比较早产大鼠与正常大鼠AECⅡ细胞EPOR的差异，以期了解早产胎肺AECⅡ损伤的分子机制，探索防治早产儿肺损伤的新途径。
1材料与方法
1.1实验动物与试剂成年SD雌鼠12只，体重200～230g，雄鼠12只，体重220~250g，由广州医学院实验动物中心提供。MEM培养基、胰蛋白酶、DNA酶I、Ⅳ胶原酶为美国Gibco公司产品。胎牛血清购自美国GIBCO公司。Trizol及MLV逆转录酶为美国Prmnega公司产品。EPOR及内参B-actin引物均由上海生工合成：EPOR(213 bp)引物上游：5'-CTGGGAGGAAGC GGCGAACT-3';下游：5'-CGGTGGTAGCGAGGAGAT -3'。B-actin(690 bp)引物上游：5'-CACCCTGTGCTG CTGCTCACCGAGGCC-3';下游：5'-CCACACAGATGA CTI'GCGCTCAGG一3'。EPOR一抗及碱性磷酸酶标记的二抗为美国Santa Cruz公司产品。
1.2方法
1.2.1早产大鼠AECⅡ的分离及培养SD大鼠按雌雄1：1合笼交配，第2日晨查见阴栓记为妊娠第1天，将孕鼠于18、20、22d(足月为22d)时行割宫产取出早产鼠，参照文献[5]方法，分离纯化AECⅡ。分离的AECⅡ按孕龄18、20、22d分为三组培养在37℃，5%CO2培养箱中，培养20天左右。
1.2.2RT-PCR检测ACE Ⅱ型细胞EPOR mRNA水平Trizol(Promega，美国)法提取各组细胞总RNA，分光光度计测吸光度A260/A280值，计算提取的RNA浓度。逆转录合成cDNA：在反应体系中分别加入样本RNA、引物等混匀后按以下条件进行反转录反应：65℃ 1min，30℃ 5min，于15~30min 内匀速升温至65℃，65℃ 30min，98℃ 5min，5℃ 5min，产物即cDNA。EPOR基因的PCR扩增：在反应体系中，分别加入：cDNA 3μl、DEPC水17.1μl、10倍缓冲液2.5μl、10mmoL/L dNTPs 2μl、5U/μl TaqDNA聚合酶0.2μl、上游和下游引物各0.1μl。 EPOR扩增条件：94℃ 3min;94℃ 40s，56.5℃ 1min，72℃ 1min，35个循环;72℃ 7min。B-actin 扩增条件：94℃ 40s，55.5℃ 1min，72℃ 1min，35个循环。72℃ 7min。上述反转录和PCR扩增所需酶和试剂购自日本TaKaRa公司。扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察并拍照，用凝胶成像分析系统进行电泳条带分析。用EPOR与B-actin扩增产物的吸光度比值来表示每个样本的相对mRNA水平。每组重复3次。
1.2.3Western Blot检测ACE Ⅱ型细胞EPOR 蛋白水平取各组ACE Ⅱ型细胞以1：5比例加入裂解缓冲液，4℃12000r/min离心1h，上清为浆蛋白组分。取上述沉淀加入膜蛋白提 取液超声波粉碎(冰水中)，4℃过夜，4℃ 12000r/min离心1h，上清为膜蛋白。采用Lowry法测定蛋 白水平，以浓度最低管为基准，调节蛋白浓度。把样 品调成相同浓度，加入样品缓冲液，沸水煮5min。十二烷基硫酸钠、聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳转印至纤维素膜上，用含0.5s/LTween 20的Tris 盐酸缓冲液(TBST)漂洗，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，TBST漂洗，加一抗EPOR(工作浓度 1：200)4℃过夜，TBST漂洗，加碱性磷酸酶标记的二抗，室温2h，TBST漂洗，最后显色。采用Fluchem凝胶分析系统进行分析。分组重复3次。
1.2.4统计学分析计量资料以x±s表示，组间比较采用q检验，P<0.05(单侧)为差异有显著性意义。
2结果
2.1胎鼠原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞已贴壁的AEC II呈铺路石状，细胞核及核仁明显，胞质内见较多颗粒(见图1)。
2.2三组AECⅡ细胞EPOR mRNA水平比较EPOR mRNA在孕22d表达最强，在孕20d和孕18d时表达逐渐减弱(EPOR与B-actin扩增产物的吸光度比值分别为：18d 1.50±0.03，20d 2.11±0.04，22d 2.55±0.05见图2)，不同孕龄间差异有统计学意义(两两比较q值分别为-13.136,-38.575,25.439，P值均< 0.05)。
2.3三组AECⅡ细胞EPOR 蛋白水平比较在孕18、20及22d时EPOR 蛋白平均光密度值分别为1.21±0.02、1.42±0.04、1.82±0.03，其表达随孕龄增加而逐渐增强，不同孕龄间差异有统计学意义(两两比较q值分别为-27.693,-47.518,-19.824，P值均<0.05)。
3讨论
与足月产新生儿相比，早产儿更容易发生肺损伤,并最终发展为慢性肺疾病(CLD) [2]。早产儿肺发育不成熟、长时间和(或)高浓度吸氧是导致CLD发生的重要因素[5]，肺泡上皮细胞是其损伤的主要靶细胞[6]。 AECⅡ是一种多功能细胞，在损伤修复过程中，可增殖分化为AECⅠ，也可通过有丝分裂补充自身的数量，以维持肺泡的结构和功能，从而在肺损伤修复过程中发挥重要作用。在早产儿肺损伤研究领域，发育中胎肺Ⅱ型上皮细胞的研究还较少。EPOR是一类新发现的细胞因子受体,通过与其配体(EPO)结合引发信号转导,具有促进血管生成、抗凋亡、抗缺氧作用，早在1998年Junl等[6]就发现了人类胎肺组织有EPOR的表达。随后EPOR在高氧肺损伤中保护作用逐渐被发现，EPOR能对氧张力的改变迅速作出反应并保护细胞免受凋亡。我们研究发现，出生前胎鼠EPOR随胎龄增长逐渐增强。据此推测，胎龄越小的早产儿AECⅡ细胞EPOR表达较低，AECⅡ细胞易受到氧化应激的损伤，从而增加肺损伤疾病的风险。另外的两篇报道[7，8]则发现出生后肺组织EPOR水平随日龄增长逐渐减弱。结合本研究结果，我们认为出生前的EPOR的增加只是临时增强表达，以应对出生时肺由低氧环境到高氧环境的强烈刺激。本研究结果提示，在出生前，AECⅡ细胞EPOR表达迅速增加，以减轻出生后肺泡内氧张力的突然增强导致的氧化损伤，提前出生的早产儿由于AECⅡ细胞EPOR表达较低，抗氧化能力削弱，容易发生肺损伤。(本文图片见封三)
【参考文献】
1李宝恒,沙金燕.围生期胎儿及早产儿肺成熟的研究进展.中国实用妇科与产科杂志,2005,21(5):317-319.
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4Yoshimi M.Recombinant human erythropoietin reduces epithelial cell apoptosis and attenuates bleomycin-induced pneumonitis in mice. Respirology,2008,13(5):639-645.
5 Altun,V.,T.E. Hakvoort,P.P. van Zuijlen,et al.,Nerve outgrowth and neuropeptide expression during the remodeling of human burn wound scars. A 7-month follow-up study of 22 patients. Burns,2001，27(7):717-722.
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8王晓蕾,富建华,薛辛东.吸入高浓度氧对大鼠肺泡发育过程促红细胞生成素受体的影响.中华儿科杂志,2011,49(5).