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1993年，比利时学者报道了服用含有广防己的减肥胶囊可以引起快速进展的肾间质纤维化，将其称为“中草药肾病”（Chinese herb nephropathy），并认为其成分中的马兜铃酸可能是导致肾脏损害的原因 ［1，5］。
1 马兜铃酸的一般毒性
马兜铃酸有肾毒性，可以造成肾脏损伤，目前已引起重视，并对其病因和临床特点进行了深入的研究。急性毒性:大、小鼠接受高剂量AA后，常呈现肾小管严重坏死，淋巴器官萎缩，前胃浅表性溃疡，鳞状上皮增生和过度角化，15d内死于急性肾衰。亚急性毒性:0.2mg/kg·d的AA连给4周，对Wistar雄性大鼠无明显影响，1.0mg/kg可引起轻度的改变，5.0mg/kg有明显的毒性，25mg/kg使肾、前胃、膀胱、睾丸出现显著的退行性变，个别可导致肾衰而死亡。临床特点是快速进行性肾间质纤维化过程，往往不可逆发展 ［2］ 。
此外，马兜铃酸还能引起其它系统的损害，如恶心、呕吐、上腹不适等消化道症状，血小板减少，肝功能异常、过敏性紫癜、神经系统损害等。
更为重要的是，长期服用小剂量含马兜铃酸的药物，不但可以导致慢性肾病，还可能致癌，尤其是泌尿系统。
2 马兜铃酸DNA加合物
DNA加合物是化学毒物经生物系统代谢活化后的亲电活性产物与DNA分子特异位点形成的共价结合物，是DNA分子化学损伤的最重要和最普遍的形式。化学毒物进入生物体后，在体内系统的代谢作用下，可形成亲电代谢产物，亲电代谢产物以共价键与DNA某些位点结合，即形成DNA加合物。DNA链上能形成加合物的位点不是任意的，而是有相当的位点选择性。马兜铃酸DNA加合物是指马兜铃酸进入人体后，代谢形成马兜铃内酰胺，进一步与DNA形成加合物 ［3］ 。
1994年首次报道了检测到马兜铃酸的DNA加合物。其中主要为dA-AAI（脱氧腺苷-马兜铃内酰胺I）。目前报道在肾实质及前胃、肝中可检测到。1996～2001年，有6组学者先后从患有中草药肾病的47例妇女、1例男子的肾脏或输尿管组织中检测出AA-特异性DNA加合物。加合物主要是脱氧腺苷—马兜铃内酰胺I（dA—AAI），其次为脱氧鸟苷—马兜铃内酰胺Ⅰ（dG-AAI）和脱氧腺苷—马兜铃内酰胺Ⅱ（dG-AAⅡ）。总的加合物水平在1.7—530/10 9 正常核苷。有学者以AA或AAⅠ、AAⅡ连续口饲Wistar大鼠，在多种器官组织上均可检测出dA-AAⅠ、dG-AAⅠ、dA-AAⅡ等加合物。
在体外实验中，有报道分别用黄嘌呤氧化物、过氧化物酶、锌和一些微粒体制备能激活AAⅠ、AAⅡ形成加合物，并认为P450IA1、IA2是微粒体激活AA的主要诱导物。
AA可以诱发啮齿类动物发生肿瘤上并有原癌基因的突变。Schmeiser HH等（Cancer Res.1990;50:5464，1991;59:139）以10mg/kg AAⅠ口饲大鼠，每周5次，连续3个月，在所试40只动物中出现15个前胃痛、7个耳道癌、23个小肠腺瘤或肉瘤、2个肺和胰转移瘤;以5mg/kg口饲小鼠连续3周，发生前胃鳞癌和肺腺瘤，均分别发现c-Ha-ras、c-ki-ras、c-N-ras等原癌基因突变，突变均发生在第61号密码子的第二或第三碱基上，使A→T（即CAA突变成CTA或CAT），dA-AA加合物的致突变性强于dG-AA加合物。Arlt AV等（2001）聚合酶终止谱实验也提示两种AA与人P53的嘌呤碱基起反应 ［7～10］ 。加合物的形成和癌变的关系一度引起一些学者的兴趣，研究发现某些化学物质通过诱导基因改变引起癌症，DNA加合物同基因改变之间的关系正在得到深入研究。DNA加合物的形成并不一定导致突变，突变并不一定导致癌变，只有当加合物形成于DNA的某一特定位点，并在复制和转录过程中引发一系列基因改变，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活，基因间的协调失去控制，才会导致细胞恶性转化。因此，只有DNA序列紊乱长时间得不到恢复，才是DNA加合物导致癌症发生的关键所在。
3 DNA加合物的检测
DNA加合物是化学毒物经生物转化后的亲电活性产物与DNA分子形成的共价结合物，是一种分子水平暴露标志物。检测DNA加合物能够提供化学毒物的代谢活化信息，尽早尽快地预防及治疗。由于DNA分子生命周期短，样品不易获得，且加合物的含量很低，因此要求检测方法具有很高的灵敏度和特异性。迄今已建立了10多种DNA加合物的检测方法，目前较为常用的方法主要有:免疫法、荧光法和 32 P—后标记法等。 32 P—后标记法由于具有极高的灵敏度（1个加合物/10 8-10 正常核酸），且不需要加合物标准等一系列优点，而成为日前测定DNA加合物的最主要方法 ［4］ 。
3.1 免疫法 基本原理是抗原与抗体的反应。已发展的方法有竞争性放射免疫测定（RIA）;互相竞争或非竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）;超敏酶促放射免疫测定（USERIA）等。其检测限一般为1个加合物/10 7 ～10 8 核苷酸，目前已有20多种单克隆多克隆抗体可供使用。免疫法的优点是简便易行，价廉，不需要酶解DNA链，有免疫沉淀技术可以将有加合物的DNA链和无加合物的DNA链分离。其缺点是抗体存在交叉反应，所需DNA量较大（25～60μg），另外对于非抗原性加合物和未知抗原加合物的检测无能为力。
3.2 荧光法 原理是通过某些化合物（特别是多芳环烃）的DNA加合物具有荧光的特性来测定，其检测限为1个加合物/10 6 ～10 8 核苷酸。荧光法的优点是不破坏DNA链就可以测定，另外可以确定加合物的不同立体异构体及DNA链上的不同位点上的加合物，也可以研究DNA加合物形成和切除与时间之间的动态关系。其缺点是所需DNA样品量大（100～1000μg），而且该法不能检测非荧光化合物的混合物质形成的加合物，所以一般只作为其它方法的补充。
3.3 高效液相色谱法及气/质谱法 高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）联合其它敏感的检测法检测DNA损伤已成为一种趋势。如HPC— 32 P后标记方法是非常敏感的方法。气/质联用法（GC—MS）虽然灵敏度稍低，但可以提供加合物准确的结构信息，这一点是其它方法不能比拟的。目前该方法多用于尿中排泄的DNA加合物检测，需水解DNA才能测定。其敏感性与荧光法相似。
3.4 32 P—后标记法 是在80年代发展起来的一个非常灵敏的检测方法，其最高灵敏度可达1个加合物/1010 ～10 12 核苷酸水平，相当于在一个细胞中有一个加合物就可以检测出，其基本原理为:（1）含有加合物的DNA链在内外切酶的作用下降解为3’单 磷酸核苷。（2）通过消除正常的核苷酸来富集加合的核苷酸。（3）在特异的T4多核苷酸激酶的作用下，将具有高度特异活性的 32 P-ATP的磷酸根基团转移到加合的核苷酸的5’-羟基末端，使其形成3’—5’二磷酸核苷。（4）将标记的加合物通过薄层层析技术分离。（5）放射自显影及定量分析，该方法自从文献上报道以来进行了很多改进，归纳起来有标准法，强化法（限量ATP法），丁醇富集法，核酸酶P1/S1富集法，双核苷酸/5’—单磷酸法，此外又发展了一些 32 P—后标记法与其它诸如免疫法，HPTC法，荧光法等结合的方法，其中以丁醇富集法和核酶富集法使用广泛。该方法的优点是所需DNA的样品量少，非常适合只能提供少量DNA的人体样本（几个μg）的检测，不需要事先制备加合物标样，用空白对照可以定量计算加合物含量，既可用于单一加合物的检测，也可用于复杂混合物的测定，及未之的内源性亲电性物质所形成的加合物的测定。其缺点是特异性较差，步骤比较多，稳定性不易掌握，不同的实验室所测定的结果差别很大。尽管有这些缺点， 32 P—后标记法为国际公认的最有发展前途的方法。
3.5 加速器质谱法 是一种超灵敏的核分析技术 ［6］ ，可以测量很多低丰度的长寿命发射性核素和稳定核素。其中， 14 C占有最重要的地位，加速器质谱法可以通过测量 14 C标记的外源物来确定环境剂量外源物在组织器官中的行踪。分离出来的成分中 14 C的量可反映出标记化合物在体内与靶分子的结合，其结合情况与外源物在宿主中的可能致癌危险性有一定关系。测量DNA加合物的探测水平达到1个加合物/10 11 ～10 12 个核苷酸，相当于可测到每毫克碳中10～18mol后更少的 14 C，可见AMS具有很高的灵敏度。
14 C生物加速器质谱法是一种比较复杂的技术，它的应用和推广也存在一些局限性，（1）速器质谱仪比较好。（2）研究中要使用有放射性的 14 C标记化合物。（3）AMS测量只能获得 14 C的定量同位素比，而无法直接反映化学结构信息。
参考文献
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（收稿日期:2004-08-08）
作者单位:100020北京市第六医院
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