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【摘要】 目的 建立非同位素标记的探针杂交测定外周血白细胞端粒DNA长度的方法，并探讨其在无偿献血中的应用。 方法 酚/氯仿提取基因组DNA，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳，非同位素标记的探针Southern印迹杂交，化学发光X线片曝光显示杂交谱带，积分光密度扫描计算TRF值。 结果 所测样本获得了较好的低背景杂交谱带，测得35～40岁无偿献血组TRF值平均为11.73kb，相应无献血史对照组平均为11.78kb。结论 建立了非同位素标记的探针检测端粒DNA的方法，用上述方法初步显示了固定的长期无偿献血并未对端粒的长度产生影响。
关键词 无偿献血 端粒 非同位素标记探针
New way of telomere length measurement and application to donation
Tao Liyang，Hu Bingjie，Zhou Haojie，et al.
Guangzhou Blood Center，Guangzhou510095.
【Abstract】 Objective To measure telomere length by hybridization with non-radio-isotopic-labeled probes，and to study its application in donation.Methods The high-molecular weight genomic DNA was prepared by standard method and digested，then hybridized by digoxin-labeled probes.The mean telomere length was calculat-ed by scanning the exposed X-ray filmwith a densitometer.Results The TRF of35～40years old donors and non-donors were11.73Kb and11.78Kb，respectively.Conclusion A digoxin-labeled and low background method for determining telomere length is established，which suggests that long-term donation doesn't affect the telomere length.
Key words donation telomere non-radio-isotopic-label
端粒（telomere）是真核细胞染色体末端的一种特殊蛋白质-DNA结构，其功能是维持染色体的稳定，使染色体免遭融合、重组和降解 ［1，2］ 。其中的重复TTAGGG序列会随着细胞的有丝分裂而缩短，与衰老和肿瘤的发生有着密切的关系 ［3，4］ 。目前端粒长度的检测方法主要是Harley ［3］ 等创建的Southern blotting方法，大都采用放射性同位素标记的探针进行杂交。虽然同位素灵敏度高、背景低，但却受到放射性、时间和半衰期等因素的制约。本实验采用地高辛标记的探针，用分子杂交技术建立了一种低背景显示端粒谱带的方法，并用该法对长期固定的无偿献血者端粒长度的改变进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料 35～40岁献血10次左右的献血者的血样20份。选择年龄段与之相匹配的初次献血者的血样20份。所有献血者均达到国家献血法规定的健康标准，血样均来自本血液中心。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取 500μl EDTAK 2 抗凝冻存全血，常规饱和酚/氯仿抽提基因组DNA。0.8%琼脂糖凝胶（含0.5mg/ml EB）5V/cm电泳0.5h，紫外灯下观察抽提效果。紫外分光光度计（Lambda3B，PE）测定260nm和280nm处的OD值。
1.2.2 基因组DNA的酶切消化 1.5μg基因组DNA，HinfⅠ和RsaⅠ各15u，37℃水浴过夜。
1.2.3 酶切样品电泳 0.8%琼脂糖凝胶（含0.5mg/ml EB）4V/cm电泳4h，并以高分子量标准DNA作为对照。
1.2.4 Southern印迹杂交 电泳样品真空转移，0.2mol/L HCl脱嘌呤5～10min，0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl变性30min;0.5mol/L Tris，3mol/L NaCl（pH7.5）中和20min，20×SSC（pH7.0）50mbar转移1h，紫外交联3min。转印后的阳离子尼龙膜（Roche）经预杂交液42℃孵育1h，带有地高辛标记探针（Roche）的杂交液42℃水浴振荡过夜。2×0.2×SSC0.1%SDS梯度洗膜4次，阻滞剂（Roche）室温孵育30min，显色剂（Roche）室温5min，X线片曝光20min，显影2～5min，定影直到谱带清晰约5min。
1.2.5 图像分析 X线片经积分光密度扫描，按照公式∑（OD i ）/∑（OD i /L i ） ［3］ 计算出端粒DNA平均长度（TRF）。L i 为处于i处的Marker分子长度，OD i 为处于i位的杂交谱带光密度值。
2 结果
实验所用DNA样品酶切后电泳紫外灯下均呈瀑布样分布，酶切完全且各电泳条带亮度相当。X线片曝光后实验组与对照组谱带清晰，密度位置相等（见图1）。经公式计算得出实验组TRF值平均为11.73Kb，对照组TRF值平均为11.78kb。两组数据的均值差异无统计学意义（t=1.037，P>0.05）。
3 讨论
端粒是维持染色体末端稳定性的一种帽状结构，可以避免染色体末端之间的相互融合，与真核细胞的衰老和永生化有着极其密切的关系。在生长过程中体细胞不断分裂增值，DNA一次又一次的被复制，由于末端复制问题每复制1次染色体末端必然会缩短50～100个碱基，当缩短到一定程度时细胞就进入复制性衰老期（replicative senes-cence），这些衰老的细胞并不立即死亡而是在p53和pRB通路都失活的情况下继续分裂增生，进入不稳定的危机期（crisis），这一期端粒将变得更短，如此短的端粒不足以维持染色体的稳定于是细胞大批死亡，仅有极少数细胞会通过端粒酶的活化获得永生 ［5］ 。由此可见，细胞的有丝分裂次数就可以通过端粒的长度变化反映出来。献血会刺激造血干细胞分裂增殖以补充损失的血液成分，测量外周血白细胞端粒DNA的长度可以间接反映出骨髓造血干细胞的分裂增殖情况 ［6］ ，借此就可以观察长期的无偿献血是否会引起端粒的缩短，是否会对献血者的造血系统产生影响。
建立非同位素标记杂交检测端粒长度的方法关键是要得到清晰的杂交谱带，这样才能准确计算出它的长度即TRF值。为此，在实验中操作要轻缓以得到大分子量的DNA片断;酶切要完全，酶的活性要先通过预试验标定;电泳采用4V/cm，并用蠕动泵交换正负极的缓冲液，保证离子强度的平衡，4℃循环水冷却电泳体系以防止热扩散;洗膜条件要适当，可有效去除非特异性结合，得到低背景的杂交谱带。从曝光的X线片看无偿献血组与对照组杂交谱带密度、位置大致相等，经积分光密度扫描和统计学分析显示两组样本差异无显著性。《中华人民共和国献血法》规定18～55周岁健康公民每隔6个月可献血1次。但目前并没有客观资料显示这样是否会对献血人员造成负面影响，对端粒长度改变的检测正好可以为此立法提供客观的理论支持。但由于实验材料的限制本研究仅选取了有10年左右献血史的个体，对献血者端粒长度的影响是否会从更多次的献血中表现出来还有待进一步的追踪研究。
参考文献
1 Moyzis RK，Buckingham JM，Cram LS，et al.A highly conserved repeti-tive DNA sequence（TTAGGG）n present at the telomeres of human chro-mosomes.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（18）:6622-6626.
2 Colgin L，Reddel R.Telomere biology:a new play in the end zone.Curr Biol，2004，14（20）:R901-902.
3 Harley CB，Futcher AB，Greider CW.Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.Nature，1990，345（31）:458-460.
4 Hastie ND，DempsterM，DunlopMG，et al.Telomere reduction in human colorectal carcinoma with ageing.Nature，1990，346（6287）:866-868.
5 Kim SH，Kaminker P，Campisi J.Telomeres，aging and cancer:in search of a happy ending.Oncogene，2002，21（4）:503-511.
6 Brummendorf TH，Rufer N，Holyoake TL，et al.Telomere length dynam-ics in normal individuals in patients with hematopoietic stem cell-asso-ciated disorders.Ann N Y Acad Sci，2001，938（1）:293-303.
（编辑吴 莹）
作者单位:510095广东广州广州血液中心
510180广东广州广州市卫生局科技教育处