点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨依达拉奉对局灶性脑缺血再灌注损伤的影响。方法 采用线栓法制备SD大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，分为假手术组、脑缺血再灌注对照组和依达拉奉治疗组，分别于缺血1h后行再灌注，设再灌注后2、6、12、24h不同时间点，检测脑组织及血清NO、T-NOS浓度。结果 对照组再灌注期间NO浓度先下降后升高，T-NOS变化与NO一致;治疗组脑组织及血清NO、T-NOS水平均明显下降,以再灌注6h最明显。结论 依达拉奉可降低NO、T-NOS水平，对缺血再灌注脑组织确有保护作用。
【关键词】 脑缺血；再灌注；一氧化氮；一氧化氮合酶
Effects of edaravone on content of cerebral and serum NO，T-NOS in rats with focal cerebral ischemia and reperfusion
ZHAO Lian-dong,JIN Guang-rong,XU Han-rong,et al.
Neurological Institute,Medical College of Southeast University,Nanjing 210009,China
【Abstract】 Objective To study whether the pathogenesis of focal cerebral ischemia and reperfusion were involved by edaravone.Methods Use rat model of a middle cerebral artery occlusion (MCAO) by suture method. Compare two above rat model samples, one with edaravone, the other without. Left middle cerebral arteries were occlused for 1 hour. Then at every 2, 6, 12 and 24 hour-point,the the content of NO and T-NOS in brain tissue and blood serum were studied.Results During cerebral ischemia and reperfusion period, content of NO was firstly down and then up, while that of T-NOS was changed accordingly. As for the model sample with edaravone,concentration of NO and T-NOS decreased more dramatically. At the very 6-hour-point, cerebral hydro percentage in edaravone samples was most significantly lower than the other. Conclusion Edaravone can lower NO and T-NOS to ease cerebral ischemia and reperfusion.
【Key words】 cerebral ischemia;reperfusion; nitric oxide; NO synthase
脑缺血后再灌注期间脑组织发生复杂的继发性改变,加重脑组织损伤,近年来随着溶栓治疗的开展,血循环重建后的再灌注损伤日益受到重视,目前认为再灌注后自由基增多是导致损伤加重的主要原因［1,3］,自由基水平及其影响因素在再灌注期间的变化规律已成近期的研究热点,其中NO、NOS等的研究较多,依达拉奉是近期研制出的新一类自由基清除剂,尚处于临床实验阶段,确切的抗自由基机制及临床疗效目前还不清楚,我们通过研究依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注期间血及脑组织中NO、NOS等水平的影响探讨依达拉奉清除自由基的有关机制及对再灌注损伤的保护作用,为临床治疗脑梗死提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组 取雄性SD大鼠54只，体重约230～260g(由东南大学医学院实验动物中心提供)，按脑缺血后再灌注不同时间窗分为9组(每组n=6)：局灶性脑缺血1h再灌注2h、6h、12h、24h组及假手术组。实验时用0.4%戊巴比妥钠(10mg/kg)行腹腔注射麻醉，手术前后动物能自由获得饮水和食物。
1.2 动物模型制作 采用改良Koizumi’s及Zea Longa［2,12］大鼠大脑中动脉(MCA)线栓/再灌注模型。局灶性脑缺血1h再灌注2h、6h、12h、24h后，以0.4%戊巴比妥钠深度麻醉后快速断头法除死，心腔取血，放置离心机中离心取血清，置于1ml离心管中-20℃冻存，待测；在冰盘上快速取脑，置0～4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，缺血侧脑组织部分用于测含水量，部分入9倍量的0～4℃生理盐水，在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆，用离心机3000rpm，离心15min，取上清液分3份，置-20℃冻存，用于测定NO、T-NOS。
1.3 给药方法 缺血再灌注治疗组于动脉阻断后30min经腹腔注射依达拉奉3mg/kgwt，皮下注射依达拉奉3mg/kgwt,30min后重复1次。对照组给予等量生理盐水。
1.4 指标检测 (1)脑组织含水量测定：用滤纸拭干脑组织表面的水分，准确称取脑组织湿重，然后置80℃烘箱中烘48h后再次准确称取脑组织干重。脑组织含水量（%）=（脑组织湿重-脑组织干重）/脑组织湿重×100%。(2)脑组织匀浆NO、T-NOS测定方法采用Misra Hp,光化学扩增法，脑组织蛋白含量测定用Follins酚试剂法。
1.5 统计学方法 各组数值均以均数±标准差（x±s）表示，以SPSS软件包处理数据。
2 结果
2.1 脑组织含水量 见表1。脑组织含水量高峰出现在再灌注后6h，与正常组比较差异有极显著性；治疗组较对照组脑组织含水量减少，差异有非常显著性（P＜0.01）。
表1 再灌注后不同时间点大鼠脑组织含水量比较 （略）
注：与对照组比较，◆P＜0.01
2.2 脑组织及血清NO、T-NOS含量 见表2、表3。对照组脑组织NO浓度于再灌注2h降低，6h升高至最高峰，以后降低，再灌注12h已接近正常水平。治疗组各时间点NO水平均明显低于对照组（P＜0.01），以再灌注后6h最明显，T-NOS水平于再灌注后2h明显升高，再灌注6h达高峰，此后开始回落，但于再灌注24h仍高于假手术组；血清中NO浓度于再灌注后即不断升高；治疗组各时间点NO水平也明显低于对照组，与对照组相比均以再灌注后6～12h最为明显（P＜0.01），T-NOS水平先升高，于再灌注6h达高峰，此后渐下降，于再灌注24h降至低于假手术组。治疗组T-NOS水平呈持续下降趋势，于12h下降至最低点，再灌注24h后略有回升。
表2 再灌注后不同时间点大鼠脑组织含量比较 （略）
注：与对照比较，★P＜0.05，★★P＜0.001，★★★P＜0.05，▲P＜0.05，▲▲P＜0.05，▲▲▲P＞0.05
表3 再灌注后不同时间点大鼠血清含量比较 （略）
注：与对照组比较，☆P＞0.05，☆☆P＜0.05，☆☆☆P＜0.05，※P＜0.05，※※P＜0.05，※※※P＜0.05
3 讨论
近年来关于NO及NOS对缺血再灌注损伤的研究颇多，但结论不一，大量研究表明NO在脑缺血中的作用是多方面的、复杂的，这可能与脑缺血的时程和NO的酶来源有关。低浓度的NO对细胞具有保护作用，其机制可能是：（1）经扩张血管而改善细胞灌注及抑制血小板功能，产生抗凝效应。（2）NO与谷氨酸的巯基结合，经亚硝酰化而形成二硫键而使谷氨酸受体调控离子通道下调，防止细胞内钙超载，另一方面也防止NO+向NO-转变，从而阻止NO-与超氧阴离子反应而产生的细胞毒性物质。在高浓度状态下（nmol水平），NO对细胞有损伤作用，与超氧阴离子反应生成超氧亚硝酸根离子，后者及其分解产物羟自由基可导致细胞毒性作用。同时还可引起细胞核酸亚硝酰化，破坏DNA结构，形成亚硝酰铁络合物，从而抑制某些细胞呼吸和DNA复制有关的酶活性［4，5］。一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸分解生成一氧化氮(NO)和瓜氨酸，NOS活性的变化反映组织内NO含量的变化。NOS活性与脑组织缺氧程度有关，脑缺氧越重，NOS活性越高，NO产生越多，也从另一侧面反映了NO与脑损伤的关系［6］。脑缺血致NOS活性增强，诱导产生大量NO，进一步加重脑损伤［5］。依达拉奉是一种新型自由基清除剂，研究［7～9］表明依达拉奉有直接清除NO、羟自由基作用及抗氧化活性。Takahashi［10，11］等的研究认为依达拉奉可通过减少神经元一氧化氮合成酶和增加内皮型一氧化氮合酶，而保护局部缺血损伤的运动神经元；Nito等研究［3］发现中风模型的沙土鼠静注依达拉奉(1.0～3.0mg/kg)，能明显抑制缺血区脑的水肿；给沙土鼠静注依达拉奉(0.3～3.0mg/kg)，能明显抑制缺血再灌注引起的白三烯合成的增加。离体牛主动脉内皮细胞培养试验表明依达拉奉可抑制花生四烯酸的代谢及由15-HPETE引起的细胞损伤。缺血前静注依达拉奉3mg/kg，可加快脑缺血模型大鼠ECG的恢复及延长大鼠生存时间；静注依达拉奉(1～3mg/kg)可减轻脑栓塞大鼠血脑屏障功能障碍及脑部能量衰竭,减轻脑梗死。
本研究对照组脑组织NO浓度于再灌注2h降低，6h升高至最高峰，以后降低，再灌注12h已接近正常水平。治疗组各时间点NO水平均明显低于对照组，（P＜0.01 ），以再灌注后6h最明显，T-NOS水平于再灌注后2h明显升高，再灌注6h达高峰，此后开始回落，但于再灌注24h仍高于假手术组；血清中NO浓度于再灌注后既不断升高；治疗组各时间点NO水平也明显低于对照组，与对照组相比均以再灌注后6～12h最为明显（P＜0.01），T-NOS水平先升高，于再灌注6h达高峰，此后渐下降，于再灌注24h降至低于假手术组。治疗组T-NOS水平呈持续下降趋势，于12h下降至最低点，再灌注24h后略有回升。表明依达拉奉抑制了某种NOS的表达。另外，从表2及表3中的数据看，NO和NOS的变化并不完全一致，可能依达拉奉对NO以直接清除作用为主,同时抑制了NOS中某种酶的表达。依达拉奉的清除自由基作用及抑制NOS作用均在给药后6h最明显，12h后效果即不理想，提示需短时程反复给药［12，13］。
本研究认为：脑缺血再灌注后由于NO的大量产生，使缺血脑组织损伤加重，这种损伤主要表现为自由基对脑组织的直接损伤作用，以及通过损伤血管内皮细胞使血管通透性增加；依达拉奉通过强有效的清除NO、抑制NOS活性，使这一损伤的环节中断，对神经细胞起保护作用。
【参考文献】
1 姜德华，金男革，玄汉石，等.大鼠急性局灶性脑缺血再灌注脑组织NO含量和NOS活性的变化.临床神经病学杂志,2000，13(4)：201-203.
2 Longa EZ, Weinstein PR,Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke,1989,20（1）:84-91.
3 Nito C,Kamiya T.The neuroprotective effect of a free radical scavenger and mild hypothermia following transient focal ischemia in rats.Acta Neurochir Suppl，2003，86:199-203.
4 司良毅. NO、NOS与缺血再灌注损伤的研究进展. 国外医学·内科学分册，1999，26(5)：211-213.
5 陈慎仁，陈林兴，陈少如.诱导型一氧化氮合酶与疾病.中国病理生理杂志, 2000，16(2)：179-183.
6 王琳，黄绍敏.缺氧缺血性脑病新生鼠中枢神经系统一氧化氮合酶的变化.中华儿科杂志，1999，37(10)：633.
7 Satoh K, Ikeda Y, Shioda S, et al. Edaravone scavenges nitric oxide. Redox Rep，2002，7(4):219-222.
8 Wu Tw,Zeng LH, Wu J,et al.Myocardial protection of MCI-186 in rabbit ischemia-reperfusion.Life Sci，2002，27(19):2249-2255.
9 Mizuno A,Umemura K, Nakashima M. Inhibitory effect of MCI-186,a free radical scavenger,on cerebral ischemia following rat middle cerebral artery occlusion.Gen Pharmacol，1998，30(4):575-578.
10 Yuki S,Kogure K.The changes of LCGU and rCBF in the MCA occlusion-recirculation model in rats and the ameliorating effect of MCI-186,a novel free radical scavenger.Mol Chem Neuropathol，1997，32(1-3):123-128.
11 Takahashi G,Sakurai M,Abe K, et al. MCI-186 prevents spinal cord damage and affects enzyme levels of nitric oxide synthase and Cu/Zn superoxide dismutase after transient ischemia in rabbits.J Thorac Cardiovasc Surg，2003，126(5):1461-1466.
12 Satoh K, Ikeda Y, Shioda S, et al. Edaravone scavenges nitric oxide. Redox Rep，2002，7(4):219-222.
13 李胜, 雷征霖.大鼠大脑中动脉阻断可逆性局灶脑缺血模型的研究.脑与神经疾病杂志，1997,5(6):341-343.
（编辑：李建伟）
作者单位： 210009 江苏南京，东南大学基础医学院神经生物研究所（△淮安市第二人民医院）