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【摘要】 目的 观察急性心肌梗死（AMI）患者外周血中CD34-阳性的单个核细胞（CD34-positive mononuclear cells，MNCCD34+）的动员及其变化规律。方法 观察AMI患者外周血中不同时间段MNCCD34+的数量，测量粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)等5项细胞因子在血浆中不同时间段的变化水平。结果 （1）MNCCD34+从AMI后便开始增加，第7天达到峰值，然后逐渐呈下降趋势，但在第28天MNCCD34+的数目仍然高于第1天。（2）心梗组和对照组MNCCD34+数目在第7天时差异有非常显著性(P＜0.001)。（3）外周血中的细胞因子G-CSF显著增高，且于第7天达到峰值。（4）单因素回归分析显示，循环中MNCCD34+的数目同血浆中G-CSF的水平密切相关(r＝0.379,P＜0.01)。结论 AMI患者外周血中MNCCD34+的数目和G-CSF水平是增高的，且二者密切相关。证明AMI后机体存在骨髓动员和自我修复现象。G-CSF是外周血干细胞的动员剂。
【关键词】 急性心肌梗死；干细胞；流式细胞术；粒细胞集落刺激因子；动员
Endogenic mobilization of peripheral blood stem cells in patients with acute myocardial infarction
HE Jun-feng，GAO Ju-ping，LI Bing，et al.
The 89th Hospital of PLA,Weifang 261021,China
【Abstract】 Objective To investigate the mobilization of CD34-positive mononuclear cells(MNCCD34+) in the peripheral blood of the patients with acute myocardial infarction(AMI). Method To examine the quantity of the MNCCD34+ after AMI, and the plasma level of granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF) at different times. Results （1）MNCCD34+ increased after the onset of AMI and peaked on day 7，then gradually decreased, but the number on day 28 was still greater than that on day 1. （2） The MNCCD34+ counts were significantly greater in the AMI group than in the control group on day 7 (P＜0.001).（3）G-CSF levels significantly increased and peaked on day 7. （4）Simple regression analysis revealed that the number of circulating MNCCD34+ positively correlated with the plasma levels of G-CSF.(r=0.379,P＜0.01).Conclusion The quantity of MNCCD34+ and G-CSF in the peripheral blood of patients with AMI is higher than the healthy people. Maybe G-CSF correlate with the mobilization.
【Key words】 acute myocardial infarction；stem cell；flow-cytomery；granulocyte colony-stimulating factor；mobilization
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）后可导致心肌细胞死亡，而心肌细胞缺乏增殖能力，在心肌损伤发生后不能再生，只能由成纤维细胞填充，最终由瘢痕组织替代，并逐步发生心室重构形成慢性心力衰竭。当前治疗AMI的方法主要有药物溶栓治疗、经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）、冠状动脉旁路移植术（CABG），虽然在一定程度上可以改善患者的症状，但均难以从根本上恢复心肌细胞数量。近年来，随着分子生物学和细胞生物工程技术的发展，以及对骨髓干细胞（marrow stem cells, MSCs）研究的深入，人们发现MSCs可以分化为心肌细胞、血管内皮细胞等，而且移植体内后可以改善心功能，从而为AMI的治疗带来了新的希望［1，2］。目前利用MSCs治疗AMI的研究大体可以分为两个方面，即骨髓干细胞移植和骨髓干细胞动员。前者程序复杂，牵涉到干细胞分离、扩增、移植途径选择等，且其体外准备时间较长，因此可能会错过AMI最佳治疗时间。而骨髓干细胞经动员后可自行归巢于心梗后心肌缺血组织，并分化为内皮细胞而在成体引起血管生成(vasculogenesis)以及在特定微环境下分化为心肌细胞，且动员程序较简单，故其应用前景会更好。Jackson等［3］研究发现，AMI后外周血干细胞增加，可能是机体对缺血后组织血管再生的一个自我修复过程。基于此，我们检测了AMI患者在不同时间段外周血中的CD34+单核细胞（MNCCD34+）的数目，来观察AMI本身是否能起到动员外周血中干细胞的作用，并探讨其与G-CSF等细胞因子的相关性。
1 对象与方法
1.1 研究对象
2003年8月~2004年5月在我院心内科住院并确诊为AMI的患者20例,男15例,女5例,年龄42～68岁,平均（50.7±4.9）岁。入选患者需满足以下条件：（1）典型的缺血性胸痛超过30min，且舌下含化硝酸甘油不能缓解；（2）心电图出现病理性Q波，血浆中的肌酸磷酸激酶(CK)增高，血管造影显示3条主要冠状动脉分支中至少有1条完全闭塞；（3）所有病人均给予PTCA治疗，同时给予肝素、抗血小板药物、血管紧张素转换酶抑制剂、他汀类药物以及β受体阻滞剂和阿司匹林进行治疗。另外选择20例因不典型胸痛通过冠脉造影排除缺血性心脏病的患者作对照，男13例,女7例,年龄42～65岁,平均（55.6±4.3）岁。对照者入选条件:对照组与AMI组进行性别、年龄配对,经病史询问无心血管疾病史,体格检查无阳性体征,胸片、心电图、肝肾功能、生化常规检查无异常者。合并严重心力衰竭、肝功能衰竭、肾功能衰竭、感染性疾病、肿瘤、外周血管病、脑卒中、血液病者予以剔除。
1.2 研究方法
1.2.1 MNCCD34+的计数
于患者入院后第1、3、7、14、28天测量AMI患者外周血中单个核细胞的数量。抽取2ml静脉血液，首先使用抗CD34+的单克隆抗体标记血液中的白细胞（由Becton-Dickinson公司提供），使用美国Coulter公司的epics XL型流式细胞仪，对标本进行二维散点荧光分析。选取合适的门后，对MNCCD34+进行测定，结果以每106个白细胞（WBC）中的MNCCD34+来表示。使用相同的方法于第1天和第7天测定对照组中外周血MNCCD34+数量。
1.2.2 血清CK值的测定
测量MNCCD34+数目的同时，测量患者血清中CK的浓度，采集血液标本后，送我院检验科，使用全自动生化分析仪（日本Roche7600型）以进行检测。
1.2.3 血清中细胞因子的测定
于AMI患者入院后第1、3、7、14、28天在进行MNCCD34+计数的同时收集患者外周血样5ml，3000r/min离心5min后，-70℃低温冻存，待标本全部采集完毕后，使用ELISA法对血液中的粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、粒单核细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、白细胞介素-3（interleukin-3，IL-3）、白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8）进行检测，浓度单位为pg/ml。ELISA试剂盒由美国Bioscience公司提供，检测灵敏度为30pg/ml,批内、批间误差均＜9.5%，操作步骤按其说明书进行。同时使用Thermos labysystem进行洗板，使用BIORAD公司的CODEC型酶标分析仪进行读数。
1.2.4 统计学方法
应用SPSS 10.0软件包进行统计分析，各统计指标以均数±标准差（x±s）表示。采用直线相关分析法分析相关指标间的相关性,计量资料的组间比较采用方差分析和q检验,P＜0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 心肌梗死病人外周血中MNCCD34+数目的动态变化
外周血中MNCCD34+从心肌梗死后便开始增加，第7天达到峰值，然后逐渐呈下降趋势，但是在第28天其数目仍然高于第1天。见图1（略）。在对照组中，第1天和第7天循环中的MNCCD34+数目几乎是相同的（113±8和117±13/106 WBCs），AMI组和对照组外周血中MNCCD34+数目在第1天的差异是没有统计学意义的。但是在第7天时它们之间有显著差异(P＜0.001)。见图2（略）。
2.2 血浆中细胞因子的水平 见表1。表1列出了血浆中CK和5种细胞因子在不同时间段的浓度。表1 血浆中肌酸激酶和细胞因子的动态变化（略）注：CK表示肌酸激酶，NS表示差异无统计意义
从表1中可以看出，CK的变化是符合AMI后的变化规律的。所测5种细胞因子中，只有G-CSF是显著增高的且于第7天达到峰值，其他几种则没有太多变化。G-CSF的动态变化见图3（略）。
因为在AMI组中只有G-CSF升高，所以我们只对对照组中的G-CSF进行了检测。对照组中G-CSF在第7天时只是轻微的高于第1天的水平（P＞0.05），然而AMI组中的第7天G-CSF的水平较同期对照组中的G-CSF要高的多（P＜0.01）。见图4（略）。
2.3 循环中的G-CSF和MNCCD34+的关系
我们使用统计学方法来寻找AMI患者外周血中MNCCD34+的数目和细胞因子的关系，单因素回归分析显示，循环中MNCCD34+同血浆中G-CSF的水平密切相关(r＝0.379,P＜0.01)，见图5。但是同其他几项因子并无显著关联，bFGF(P＝0.06),GM-CSF(P＝0.24),IL-3(P＝0.56),IL-8(P＝0.09)。
3 讨论
传统观点认为，骨髓干细胞（marrow stem cells, MSCs）属于机体组织特异性干细胞，只能定向分化为各系细胞和免疫细胞。近年研究［4，5］发现，某些成体干细胞不但能再生其特定组织，而且可在一定环境下转变生成其他组织系统的细胞，即跨系统甚至跨胚层分化发育，这种特性被称作“可塑性（plasticity）”或“横向分化（transxdifferentiation）”。目前认为骨髓中主要含有以下两类干细胞：骨髓基质干细胞（bone marrow stromal stem cells）和造血干细胞（HSCs），均属于骨髓单个核细胞群。近来研究［1］发现骨髓基质干细胞分化能力极强，可以分化为包括心肌细胞在内的多种组织细胞。许多实验［3，6］证实HSCs也具有多向分化的潜能，HSCs通过不对称分裂，一方面可维持自身干细胞的数量相对稳定，另一方面则可分化为各种血细胞和其他组织细胞如心肌细胞、平滑肌细胞以及血管内皮细胞等。
目前MSCs动员机制的研究主要局限在HSCs动员方面。研究表明，MSCs动员是一个相当复杂的过程，这一过程是由黏附分子、趋化因子、生长因子及一些蛋白水解酶、一氧化氮合酶和集落刺激因子等多种因素共同时序性作用完成的［7］。经动员之后的MSCs发挥损伤修复需要经历以下过程：干细胞归巢及归巢后的局部修复。所谓归巢，对损伤部位来说其实是一个捕获MSCs的主动过程。MSCs可通过细胞与内皮间相互黏附、趋化因子的趋化等多种机制共同作用来完成归巢运动。许多研究都证实AMI时损伤处微血管内皮细胞黏附分子表达增多，一方面可介导炎性细胞的黏附而发生炎性反应，另一方面则可能增加损伤处对干细胞的捕获，从而加强局部的修复［8］。MSCs归巢后对损伤局部修复的确切机制还不清楚，根据当前的研究，认为MSCs定居到损伤心肌后，可在局部微环境诱导下分化成为心肌细胞和原始的血管结构，即MSCs的成肌性和成血管性。亦有观点认为MSCs与原有心肌细胞发生融合而产生治疗作用［9］。
在生理状态下，MSCs主要存在于骨髓中，外周循环中仅有少量MSCs，被称作循环干细胞（circulating stem cells, CSCs），主要为表面标记CD34+的外周血单核细胞（MNCCD34+）。而在病理情况下，机体可释放更多的MSCs到外周血循环中［10］。研究表明［3，10，11］，AMI时机体这种自发性的CSCs数量增加可以进行心肌修复，但通常这种机体自身代偿修复不了大面积坏死的心肌组织。因此，在机体损伤时人为增加CSCs数量，即进行骨髓干细胞的动员，从而更大限度地进行损伤修复，则成为一种崭新的、有前景的治疗思路。Pettengell等学者［12］研究发现经动员的外周血中的干细胞与正常骨髓数量相当甚至高于骨髓。由于干细胞没有明确的形态学特征，都表现为淋巴样的单核母细胞，故目前大多数研究将CD34+细胞视为干细胞，并以CD34+细胞作为干细胞生物学活性与临床应用的源细胞。采用G-CSF动员后采集外周血干细胞不仅无骨髓穿刺获得干细胞的缺点，而且可以获得更加丰富的单个核细胞与CD34+细胞。Orlic等［6］正是基于此设想，通过注射G-CSF到实验心肌梗死大鼠，观察其治疗效果。结果发现，经过细胞因子治疗后新生心肌组织修复了梗死灶的大部分。陈运贤等［13］发现在心肌梗死大鼠皮下注射G-CSF 24h后，梗死区内有大量MNCCD34+浸润，并逐渐分化为心肌样细胞，认为细胞因子动员骨髓干细胞治疗心肌梗死类似于自体干细胞移植，但由于无须干细胞的采集、分离和再输注，避免了外科干预，从而具有更好的临床应用前景。
本实验即将外周血中MNCCD34+视为干细胞，应用流式细胞术计数法，观察AMI患者MNCCD34+数量变化情况。结果发现，AMI患者MNCCD34+数量升高，其峰值出现在AMI后第7天，28天后仍维持在较高水平。提示AMI后存在外周血干细胞增加，即AMI本身存在骨髓动员作用。AMI后骨髓干细胞自我动员，可能是机体对缺血后组织血管再生的一个自我修复过程，其机制可能是缺血后局部分泌某些细胞因子所造成。这一推测在本实验亦得到验证：在所测的5项细胞因子中，G-CSF显著增高，且于第7天达到高峰，单因素回归分析显示，MNCCD34+数目同血浆中G-CSF的水平密切相关，这也提示G-CSF可作为骨髓干细胞的动员剂。AMI时机体的这种自我修复作用较弱，不能满足大面积心肌损伤修复的需要，因此，可采用骨髓干细胞动员剂将骨髓干细胞动员至外周血中，增加外周血干细胞数量，从而促进心肌组织和血管的修复和再生。
综上所述，MSCs动员可出现在AMI后坏死心肌的自我修复过程中，只是这种动员作用满足不了机体修复损伤的需要。MSCs动员作为治疗AMI的一种新方法，有易行、安全等优点，尤其是MSCs自体原位移植，由于其仅需有效动员剂即可刺激机体产生有治疗效应数量的MSCs，不需分离、培养、移植等繁琐过程，也不必担心异体排斥反应，在MSCs移植治疗AMI领域中显示出广阔的应用前景。但这一治疗方法刚刚起步，目前有下述问题尚待解决：（1）目前对心肌梗死时骨髓动员的研究是借用外周血干细胞骨髓移植的方法，针对心肌梗死治疗性动员有待进一步研究；（2）骨髓干细胞向受损心肌的归巢是如何实现的？（3）骨髓动员剂的剂量选择问题，即用多大剂量的骨髓动员剂能够使归巢时间窗内外周血有足够的干细胞数量；（4）干细胞的最佳归巢时间如何把握，以便选择最佳动员时机；（5）一系列理论问题尚待解决，如骨髓干细胞的分化机制还不清楚，干细胞在缺血区生存和继续增殖多长时间？完全分化后能否有效地行使功能？尽管需要解决的问题还很多，但随着理论基础的进一步明确，更加特异性的动员剂的问世，相信这一新兴的治疗心肌梗死的方法会更加有效和安全。
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作者单位： 261021 山东潍坊，解放军第89医院心内科
（编辑：李建伟）