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【摘要】 目的 观察甲状腺素对SD大鼠胰岛B细胞凋亡核苷酸、Caspase-3、Bcl-2的影响，以阐明甲状腺功能亢进时合并糖尿病或葡萄糖耐量降低的可能病理机制。方法 末端标记dUTP（TUNEL）法观察SD大鼠胰岛B细胞凋亡核苷酸、免疫组织化学观察Caspase-3和Bcl-2的表达阳性率变化。结果 （1）小剂量甲状腺素对在体SD大鼠胰岛B细胞凋亡核苷酸、Caspase-3表达阳性率明显高于对照组（P＜0.01），而Bcl-2的表达率明显低于对照组（P<0.01），具有显著的诱导大鼠胰岛B细胞凋亡的作用；（2）同时甲状腺素喂饲后的大鼠胰腺腺泡细胞明显发生脂肪变性。结论 甲状腺素对在体大鼠胰岛B细胞具有明显诱导凋亡的作用，此作用在甲状腺功能亢进时对糖的代谢异常具有重要作用，可能是甲状腺功能亢进时合并糖尿病及糖耐量异常的重要的病理机制。
【关键词】 甲状腺素；B细胞；凋亡；TUNEL；Caspase-3
The effects of thyroxin to the apoptosis of pancreatic β cells in rats
CHEN Kuan-lin,FANG Ming-ming,SUN Guo-qing,et al.Clinical Department，Jiangsu Staff’s Medical University,Nanjing 210029,China
【Abstract】 Objective Patients with hyperthyroidism are mostly suffering from diabetes mellitus or impaired glucose tolerance，but the mechanism is uncertain by now，in order to research this we studied the role of low dosage of thyroxin to the apoptosis of pancreatic β cells in rats.Methods Observing the apoptotic nucleosides with terminal UTP nick end labelling (TUNEL), Caspase-3 and Bcl-2 with immunochemo histology of pancreatic β cells in rats.Results (1) Low dosage of thyroxin has the significant role to the apoptosis of pancreatic β cells in rats，the positive rates of apoptosis nucleosides, Caspase-3 and Bcl-2 expressions are higher compared to the normal ones respectively (P<0.01 respectively).(2) Low dosage of thyroxin has the role inducing the fatty degeneration of pancreatic acinar cells.Conclusion Thyroxin has the significant role to the apoptosis of pancreatic β cells in rats,and this effect maybe play a very important role in the mechanism to diabetes mellitus or impaired glucose tolerance in patients with hyperthyroidism.
【Key words】 thyroxin；B cells；apoptosis；TUNEL；Caspase-3
长期以来人们发现甲状腺功能亢进（简称甲亢）患者常常同时合并糖耐量异常或糖尿病，人们对此通常的解释是甲亢时由于脂肪和蛋白质的分解代谢加强而抑制了糖的分解代谢。事实是并非所有甲亢患者都合并有上述表现，而合并有上述表现者部分在甲亢控制后得到恢复，部分患者可能从此罹患糖尿病，因此上述解释可能只是其机制的一个方面。为了探讨是否存在其他机制，譬如是否与甲亢时过量甲状腺素诱导胰岛B细胞凋亡有关，笔者观察了小剂量甲状腺素喂饲后对正常大鼠胰岛B细胞凋亡的影响，结果显示小剂量甲状腺素不但可以诱导大鼠胰岛B细胞凋亡，而且还可引发胰腺腺泡细胞的脂肪变性，据此我们推测，此病理变化与甲亢时合并糖耐量异常或糖尿病的发病机制有关。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 实验动物 年龄3个月左右，体重210~240g的SD大鼠。购买后正常饲养1周，选择健康大鼠20只进行实验，雌雄各半。SD大鼠购自南京盛名科研动物中心。
1.1.2 试剂与药物 （1）TUNEL、Caspase-3及Bcl-2免疫组化试剂：购自武汉博士德（Boster）生物工程有限公司。免疫组化试剂采用即用型SABC试剂盒，产品编号SA1022。（2）甲状腺素（优甲乐）：德国默克公司生产临床用优甲乐（L-T4），生产批号3333101，进口药品注册号H20040357。
1.1.3 仪器 （1）大鼠饲养笼；（2）莱卡切片机、光学显微镜、加样器、烤箱、低温冰箱。
1.2 方法
1.2.1 动物分组、用药 SD大鼠购买后在室温、自然光条件下室内饲养1周，观察选择健康鼠20只，雌雄各半，随机分为实验组14只（E组，n=14），正常对照组6只（N组，n=6），标号分笼单独饲养。优甲乐以注射用生理盐水溶解，每日定时称重后E组按1μg/kg体重优甲乐灌胃，N组以相应剂量单纯生理盐水灌胃，每日1次，连续2周。实验期间常规专用大鼠饲料饲养（购自南京医科大学实验动物中心）。
1.2.2 染色及免疫组化 严格按相关试剂说明书要求进行，Caspase-3和Bcl-2抗原修复采用煮沸法。所有染色均经苏木素轻度复染。
1.2.3 切片观察及数据分析 阳性结果：TUNEL阳性核为棕黄色，阴性核为蓝色；Caspase-3和Bcl-2细胞质为棕黄色。所有切片在油镜下（10×100）选择5个视野共观察100个胰岛B细胞，计算其阳性率，阳性率（%）=（凋亡细胞数/100）×100%。分别做组间阳性率均数t检验和组间阳性率平均值向量比较，结果由SAS 6.12统计分析软件进行统计分析（α=0.05）。
2 结果
实验过程中无实验动物死亡。阳性率以均数±标准差（x±s）表示，各组实验结果阳性率见表1。
表1 实验阳性率结果 (略)
2.1 阳性率均数t检验结果 E组Caspase-3、TUNEL阳性率明显高于N组，差异有非常显著性（P分别<0.01）；E组Bcl-2表达率则明显高于N组，差异有非常显著性（P<0.01）。
2.2 两样本平均值向量比较 Bcl-2、 Caspase-3、TUNEL在两组间差异有显著性，P分别为0.0001，并且两组之间各指标拟合较好（R2=0.63），表现出较高的一致性。
3 讨论
细胞凋亡是生理状况下的细胞程序性死亡，是多种基因及相关因素共同调节的结果，并且通过JNK、PKC［1］途径完成。其特征性表现是细胞骨架扰乱、黏附能力降低、胞膜皱缩、细胞质和细胞核浓缩、染色质边集和降解。这种细胞动力学特征有利于机体功能的维持［2］，然而外来或人为的因素过度诱导细胞凋亡的结果是导致机体功能的紊乱和丧失。对细胞凋亡的观察最直接的方法是凋亡小体的形成，然而这种由质膜包裹180~200bps DNA片段的形成的分子机制比较复杂，通常是通过多种相关基因功能的改变引起相应蛋白和酶的改变实现的，比如BCL-2/Bcl-2、P53/p53、CASPASE/Caspase、FAS/Fas等。
Bcl-2是由BCL-2基因编码的239个氨基酸组成，分子量为26KDa的蛋白质，最早由Tsujimoto［3］等在研究滤泡性非霍奇金B淋巴细胞瘤时发现。其后的一系列研究发现，其表达增高可以抑制细胞的凋亡，相反表达的减少或缺失会导致细胞凋亡的加速，尽管其确切机制仍不十分清楚，但其具有抗氧化、抑制Caspase、抑制线粒体释放凋亡蛋白、维持细胞内Ca2+稳态等作用［4］，同时对T、B淋巴细胞的记忆功能及多种生长因子均具有影响作用，因此被认为是阻断程序性细胞死亡的最后共同通路。
Caspase即含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific protease），作为白介素-1转换酶（ICE）同源基因产物，目前记录的至少有10个，而其中Caspase-3是细胞凋亡中最重要的酶之一, 通过蛋白水解作用灭活DFF45 (DNA fragmentation factor-45)/ICAD (inhibitor of caspase-activated DNase)而阻断了抑制因子相关的内核苷酸酶的活性，从而诱导细胞凋亡［5］，在所有的Caspase中起中心环节的作用。当然，Caspase的促进凋亡的作用受到诸如Bcl-2、Ca2+等因素调节，并且发现Bcl-2对Caspase的调节作用与其自身的磷酸化有关［6］。无论通过何种方式诱导的细胞凋亡，其最本质表现是核苷酸断裂后形成180~200bps的DNA片段，因此利用其断裂的末端或缺口与标记的dUTP结合而显示出来，细胞核内大量DNA片段的产生反应了细胞凋亡的存在和程度。
本组实验结果显示，在小剂量甲状腺素的作用下，E组大鼠胰岛B细胞内的Bcl-2表达降低，Caspase-3的表达明显增高，TUNEL检测显示大量凋亡DNA片段的存在，N组大鼠则无上述现象，这说明小剂量甲状腺素对在体大鼠胰岛B细胞具有较强的诱导凋亡作用，与相关结果一致［7］。
由于甲状腺素的上述作用，胰岛素的分泌水平降低，肝糖原的合成减少，血糖水平升高，这很可能与临床甲亢患者的糖耐量异常或合并糖尿病的发病机制有关，而并非完全如既往所推测的因脂肪和蛋白质分解增强而抑制了糖代谢使然。同时，国外学者研究还发现［7］，上述诱导凋亡作用在撤药后一段时间可以得到恢复，与临床甲亢控制或恢复后的糖耐量异常或糖尿病症状的恢复或消失相一致。此外，我们在实验中还观察到E组胰腺腺泡细胞出现明显脂肪变性，而N组未出现此种现象，其机制不详。
上述实验结果和相关研究表明，过量甲状腺激素诱导的胰岛B细胞凋亡与甲亢发病时的糖耐量异常或糖尿病症状可能存在密切关系。当然，甲亢尤其是Graves病时发病机制复杂，如Graves病时存在的自身免疫机制也可能诱导胰岛B细胞凋亡，因此，甲亢时糖耐量异常或合并糖尿病是否还与其他机制有关以及其可能相关机制仍有待进一步探讨。
【参考文献】
1 He H, Li HL, Lin A,et al. Activation of the JNK pathway is important for cardiomyocyte death in response to simulated ischemia.Cell Death Differ，1999，6(10):987-991.
2 Kerr JFR,Wyllie AH,Currie AR.Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239-257.
3 Tsujimoto Y, Cossman J, Jaffe E, et al. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma.Science，1985，21：228(4706):1440-1443.
4 Kim R, Emi M, Tanabe K. Role of mitochondria as the gardens of cell death.Cancer Chemother Pharmacol，2005，21:1-9.
5 Wolf BB, Schuler M, Echeverri F, et al. Caspase-3 is the primary activator of apoptotic DNA fragmentation via DNA fragmentation factor-45/inhibitor of caspase-activated DNA inactivation.J Biol Chem,1999，274（43）：30651-30656.
6 Hallin U, Kondo E, Ozaki Y，et al. Bcl-2 phosphorylation in the BH4 domain precedes caspase-3 activation and cell death after neonatal cerebral hypoxic-ischemic injury.Neurobiol Dis，2005，4.
7 Jorns A, Tiedge M, Lenzen S. Thyroxine induces pancreatic beta cell apoptosis in rats.Diabetologia，2002，45(6):851-855.
作者单位： 1 210029 江苏南京，江苏职工医科大学临床教研室
2 210006 江苏南京，南京秦淮医院病理科
(编辑：刘 俊)