轮状病毒感染细胞蚀斑纯化及感染性滴度测定

【摘要】  目的建立稳定易操作的轮状病毒（RV）蚀斑滴定方法，为纯化和定量测定RV感染性研究提供简易可行的技术。方法胰酶处理的SA11和Wa株RV吸附MA 104细胞单层，覆盖0.9%琼脂（含1 μ/ml胰酶），4天后再覆盖一层含有0.9%中性红的琼脂，观察和计数蚀斑，经蚀斑纯化和传代，测定病毒感染性滴度。结果第二层琼脂覆盖后1~2天可见到明显的蚀斑形成；经蚀斑纯化后病毒感染性滴度可达107~108（PFU/ml）；可提高0.62（Wa）和0.73（SA11）（LgPFU/ml）感染性滴度。结论建立了RV蚀斑纯化和蚀斑滴定测定法简便可行，为进一步研究RV的感染性及免疫原性提供了可靠的实验基础。

【关键词】  轮状病毒 蚀斑纯化 蚀斑测定

    Plaque assay for purifying and measuring infectivity of rotavirus

    WEN Yu-ling,YIN Xing-xiao,LI Chuan-yin,et al.Institute of Medical Biology,Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College,Kunming 650118,China

    ［Abstract］ObjectiveTo establish a simple,quantitative and stable plaquing assay to purify rotavirus (RV) and provide  feasible technique to measure RV infectivity.MethodsThe  RV SA11 and Wa treated with trypsin absorbed onto MA104 cells,a 0.9% agar-MEM overlay (containing 1 μg/ml trypsin) was applied.After four days the nutritious layer containing neutral red was overlaid.When plaques appeared,plaques counting and purification was carried out.ResultsObvious plaques which were clear and round in different size were formed in 1~2 days after second overlay.After purification,titers of RV strain SA11 and Wa could be measured to 107~108 (PFU/ml) respectively,could improve the RV infectivity by 0.62 or 0.73 (lgPFU/ml).ConclusionA simple and convenient plaque assay is established for purifying RV and measuring RV infectivity.

    ［Key words］rotavirus;plaque purification;plaque measurement

    目前常用的病毒滴定方法有两种，即以微量细胞病变为基础的组织细胞培养半数感染剂量（TCID50）和以蚀斑形成单位（PFU）为基础的蚀斑滴定法。TCID50只能测定使50%细胞感染的病毒剂量，而不能准确测出感染性病毒的颗粒数，而蚀斑法则能准确测出病毒样品中感染性病毒颗粒数，是较可靠的病毒感染性滴度定量测定法。病毒的免疫原性强弱及能否准确定量是病毒疫苗及免疫试剂质量等的重要保证。本研究运用蚀斑滴定、蚀斑纯化和感染性滴定技术，对两株适应常规细胞培养的轮状病毒SA11和Wa株进行了研究，初步建立了简便易行的RV蚀斑纯化和感染性滴定方法。

    1材料与方法

    1.1细胞，病毒MA104细胞株，由本实验室保 存。按常规方法传代培养，取48 h内长成的单层细胞，用于实验。SA11，Wa株，由本实验室保存。将病毒接种于MA104细胞单层，17~24 h病变约90%时，收获。-20 ℃冻融2次，4 000 rpm 4 ℃，离心10 min。取上清，-20 ℃保存备用。   

    1.2试剂MEM培养基（Sigma），琼脂（DFICO），中性红（BIO BASIC），Earle溶液（自配）。   

    1.3蚀斑纯化病毒［1］   

    1.3.1细胞单层的制备将100 ml小方瓶内长成单层的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，加入20 ml含10%的小牛血清MEM营养液制成细胞悬液，种于6孔板，3 ml/孔，37 ℃ CO2孵箱培养，待细胞长成单层（约30 h）后，用PBS洗6孔细胞板2次，加入无牛血清MEM维持液，于37 ℃ CO2孵箱培养18 h［2］，用于后续实验。

    1.3.2病毒的稀释和种毒在病毒悬液中加入10 μg/ml胰酶，置37 ℃水浴箱中孵育1 h后，用含1 μg/ml胰酶的MEM维持液将该病毒做10倍连续稀释，然后接种于6孔板细胞（之前吸干6孔板细胞旧液，每孔加入1 ml含1 μg/ml胰酶的MEM维持液），100 μl/孔。每稀释度两孔，同时设细胞对照孔，置37 ℃ CO2孵箱吸附4 h,每隔30 min摇一次。

    1.3.3第一覆盖层的制备及覆盖0.9%琼脂-MEM营养覆盖层的制备：用等量的无牛血清的双倍MEM维持液和1.8%琼脂混匀，加入1 μg/ml胰酶，42 ℃保温备用。吸弃吸附后的病毒液，用维持液洗细胞一次，每孔加入0.9%琼脂-MEM营养液2 ml。待完全凝固后，翻转培养板，放37 ℃ CO2孵箱培养4天。

    1.3.4第二层覆盖营养液的制备及覆盖0.9%琼脂-Earles覆盖液的制备：用等量（含100 μg/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，0.2% NaHCO3，0.004%中性红）的双倍Earles液与1.8%琼脂混匀，待温度降至42 ℃即可覆盖，1 ml/孔，待凝固后，翻转放37 ℃ CO2孵箱避光培养1~2天后即可观察出斑情况。

    1.3.5病毒的蚀斑纯化选择病毒蚀斑形态较好的单个斑，用吸管吸取，加入含0.5 ml MEM维持液的离心管中，反复吹打后，低速离心，吸取上清（病毒）液，经4次传代扩增，保存病毒种子，并进行病毒蚀斑形成检测，感染性滴度测定和病毒基因组RNA检测。

    1.4蚀斑滴定计数试验如上按1.3.1~1.3.4的方法，在6孔细胞板单层的细胞上进行病毒接种和琼脂层覆盖。待细胞单层上出现明显的蚀斑时，计数蚀斑数（PFU/ml）。

    病毒蚀斑形成单位的滴度计算方法，以1 ml中所含的蚀斑形成单位的数目来表示。用简单公式：A=a×b/v计算；A:每毫升病毒中蚀斑形成单位的数目；a：平均每孔中出现的蚀斑数；b：病毒稀释倍数；v：每孔接种的病毒体积。

    1.5病毒的感染性滴度（TCID50）检测［3］

    1.5.1细胞单层的制备将100 ml小方瓶内长成单层的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，加入12 ml含10%的小牛血清MEM营养液制成细胞悬液，种于96孔板，100 μl/孔,37 ℃ CO2孵箱培养。待细胞长成单层（约48 h），用PBS洗96孔细胞板2次，加入无牛血清MEM维持液（含100 μg/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，0.03%谷氨酰胺，0.2% NaHCO3）,100 μl/孔，于37 ℃ CO2孵箱培养过夜，用于后续实验。

    1.5.2TCID50滴定首先在病毒悬液中加入10 μg/ml胰酶，放37 ℃水浴孵育1 h后，用无牛血清MEM维持液（含1 μg/ml胰酶）10倍连续稀释，然后将以上96孔板细胞单层的旧液倒弃，加入上述无牛血清MEM维持液（100 μl/孔）及不同稀释度稀释的病毒液（100 μl/孔），每稀释度加4孔，同时设置细胞对照孔。放37 ℃ CO2孵箱培养，第3、6天在显微镜下观察细胞病变（CPE）情况，以使感染细胞在第6天病变达50%以上的稀释度作为判定结果，按Reed-Muench法计算出感染性滴度TCID50值。

    1.6病毒基因组RNA的检测取经4次传代扩增的病毒液样品，用酚-氯仿抽提提取病毒核酸，并检测病毒基因RNA［4］。

    2结果

    2.1蚀斑的形成经病毒吸附，覆盖第一层琼脂及加盖含有中性红的第二覆盖琼脂1~2天后，细胞单层上可见明显的蚀斑形成，斑呈圆型，蚀斑大小不完全相同，但边缘清晰，见图1、图2。通常Wa病毒株要比SA11病毒株出斑较晚较小，但出斑较为均匀。

    2.2相同温度不同吸附时间对蚀斑的影响病毒吸附的时间对出斑影响的观察结果显示，吸附2 h和4 h的病毒蚀斑数分别为107.77PFU/ml和108.38PFU/ml，4 h的比2 h略高。

    2.3细胞单层种毒前换液时间长短对蚀斑的影响种毒前6孔板细胞单层用PBS洗后，加入无牛血清MEM维持液，放37 ℃ CO2孵箱培养过夜（18 h）和不过夜(1 h)，其他过程同1.3，观察和记录蚀斑数，共做2次，结果见表1。表1SA11病毒种毒前换液时间长短对蚀斑滴度的影响

    2.4细胞微量滴定法与蚀斑滴定法的比较用观察细胞病变（CPE）的病毒感染性滴度微量滴定法（见1.5.1~1.5.2）和蚀斑滴定法（PA）（见1.3）同时测定SA11，结果见表2。经统计学处理（SPSS软件）P=0.178，P>0.05，差异无统计学意义。 表2SA11病毒蚀斑测定法与微量滴定法的比较

    2.5SAII病毒蚀斑滴定重复性的比较相同的病毒，相同的方法，4次滴定，结果见表3。经统计学处理（SPSS软件），病毒蚀斑滴定重复性比较，SA11病毒株P=0.901，Wa病毒株P=0.814，P>0.05，差异无统计学意义。表3轮状病毒SA11、Wa病毒株蚀斑滴定重复性试验

    2.6蚀斑纯化病毒取经蚀斑纯化和增殖后的病毒样品，提取病毒核酸RNA，用1.2%琼脂糖、PAGE电泳检测是否含该病毒核酸。并用蚀斑滴定法测定滴度，比较其结果，见表4、图2。 表4轮状病毒蚀斑克隆纯化前后蚀斑滴定的比较

    3讨论

    覆盖层琼脂的浓度我们摸索过0.8%、0.9%、1.0%，而以0.9%较好，同时也做过琼脂糖与琼脂的比较，琼脂要比琼脂糖好些。在覆盖琼脂时，特别在覆盖第一层时，要注意控制温度在42 ℃左右，温度高了，细胞易死亡，并且胰酶容易失活，影响出斑。温度低了，琼脂易凝固。

    在细胞洗涤后，加病毒液前，加维持液培养过夜（约18 h）比不过夜PFU滴度要稍高（见表1），虽然没有明显差异，但还是有一定的影响。加病毒后，同一株病毒（SA11）37 ℃吸附4 h比吸附2 hPFU滴度高出0.61 g。说明SA11在37 ℃吸附4 h比吸附2 h的感染性要高，至于感染性高峰在哪个时段，我们还有待于进一步研究。从表3的数据得出，SA11和Wa两株病毒的P值都大于0.05，无显著性差异，说明蚀斑滴定法测定SA11和Wa病毒株的重复性比较好，即影响因素少。细胞微量滴定法与蚀斑滴定法的比较没有差异，但是，从蚀斑滴定的出斑数，除了可以知道该病毒的感染滴度外，还可以直接知道病毒的颗粒数及病毒毒力的强弱。并且从斑的大小和形态就能判断为不同病毒株。例如从图1、图2可见Wa的斑要比SA11小。

    在蚀斑克隆时，我们选择出斑块、蚀斑形态好的单个斑挑取，以便提高病毒纯度和感染力。从表4和图2看出，相同浓度的病毒，经克隆纯化过的要比未克隆纯化过的出斑率高，滴度相应也就高；另外，SA11比Wa出斑块，可能主要是SA11来源于猴子，较Wa在MA104细胞上敏感，所以SA11在MA104细胞上的感染性滴度要比Wa高。

    从琼脂糖核酸电泳检测来看（见图3），蚀斑克隆纯化过的病毒核酸分子量与RV核酸相同。要特别说明的是在PAGE核酸电泳中Marker（见图4）与病毒核酸条带的相对位置比在琼脂糖核酸电泳中稍高一点，可能是由于本实验采用的是DNA Marker，而在PAGE凝胶电泳中DNA与RNA泳动的速度不同，故分子量Marker的指示有一定差异。

【参考文献】
  1赵铠，张以浩，李河民.医学生物制品学，第2版.北京：人民卫生出版社，2007，225-226.

2James Gray，Ulrich Desselberger.Rotaviruses methods and protocols.Humana Press,2000,47.

3文喻玲，赵庆欢，于洋，等.氯化铯密度梯度离心纯化轮状病毒.中华现代内科学杂志，2007，4（3）：195-197.

4陈元鼎，戴国珍，李军，等.聚丙烯酰胺疑胶电泳(PAGE)检测肠道腺病毒的实验研究.中华流行病学杂志，1989，10（8）：366-368.

作者单位：650118 云南昆明，中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所（△通讯作者）