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【摘要】 目的 研究乌司他丁（ulinastatin, UTI）对急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）大鼠肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxysome proliferator-activated receptorγ, PPAR-γ）表达的动态影响。方法 将SD大鼠随机分成空白组、模型组和乌司他丁治疗组，采用腹腔注射D-氨基半乳糖（D-galactosamine, D-Gal）、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）建立急性肝衰竭大鼠模型。治疗组在造模前30min腹腔注射UTI，各组于造模后6h、12h、24h、48h 4个时间点留取大鼠血及肝脏标本。观察大鼠肝功能及肝脏病理变化；RT-PCR法测定各组肝PPAR-γ mRNA表达水平；ELISA法测定血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α），白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）水平。结果 肝衰竭模型组大鼠肝PPAR-γ mRNA表达明显低于空白组，乌司他丁治疗组大鼠肝PPAR-γ水平明显高于模型组，组间比较差异有显著性。结论 乌司他丁可能通过提高PPAR-γ mRNA水平对急性肝衰竭起到保护作用。
【关键词】 内毒素；急性肝衰竭；乌司他丁；过氧化物酶体增殖物激活受体
Effect of ulinastatin on PPAR-γ in liver tissue of endotoxin-induced acute liver failure rat models
LU Jie, CHEN Yong-ping, ZHANG Xiao-hua, et al. Department of Infection and Liver Diseases, the First Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College, Wenzhou 323000, China
［Abstract］ Objective To investgate the effect of ulinastatin on peroxisome proliferators-activated receptor γ（PPAR-γ） in the liver of the acute liver failure model rats induced by endotoxin.Methods 72 SD rats were divided into 3 groups randomly: control group, model group and treatment group. The model of acute liver failure was induced by injecting lipopolysaccharide （LPS） and D-galactosamine （D-Gal） into abdomen. Ulinastatin was injected into the abdomen of the rats in treatment group, and 30 minutes later LPS and D-Gal were injected into the other side abdomen. At 6h, 12h, 24h, 48h after the establishment of models, serum and liver samples were collected from rats to determine the levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6） by ELISA, and PPAR-γ mRNA by RT-PCR. Pathologic change of liver tissue was examined by microscope.Results The levels of IL-6 and TNF-α of serum in treatment group were obviously reduced than those in model group （P<0.05）;The level of PPAR-γ mRNA of liver tissue in treatment group was higher than that in model group（P<0.05）.Conclusion Ulinastatin has a protective effect through the way of promoting PPAR-γ mRNA level to the acute liver failure model rats induced by endotoxin.
［Key words］ endotoxin; acute liver failure; ulinastatin; peroxysome proliferators-activated receptor
乌司他丁（ulinastatin, UTI）是一种胰蛋白酶抑制剂，在男性尿液中提取，可以抑制多种蛋白酶，临床上主要用于重症胰腺炎的治疗［1］，近几年研究发现，它对各种炎症细胞因子的产生和释放有明显的作用，因此广泛应用于外科手术、烧伤、休克等疾病［2］，对急性肺损伤［3］、肝脏的缺血再灌注损伤也有一定的保护作用［4］。急性肝衰竭是肝细胞大面积坏死引起肝功能严重障碍所导致的综合征，而细胞因子水平的改变、氧化应激、脂质代谢的障碍是肝损伤的主要病理机制［5］。过氧化物酶增殖物激活受体PPAR-γ是属于配体激活的一类核转录因子超家族成员，在炎症、脂质代谢、糖代谢和肿瘤中起着重要的调节作用［6］。本研究通过观察乌司他丁对内毒素诱导大鼠PPAR-γ mRNA以及其他炎症细胞因子的变化，进一步探讨乌司他丁在急性肝衰竭中的抗炎保护作用。
1 材料与方法
1.1 试剂 内毒素（LPS）购自北京宝希迪科技有限公司。D-Gal购自江苏南通通吕生物制品有限公司。UTI购自广东天普生化医药股份有限公司。TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。PPAR-γ引物由上海生物工程技术公司合成，RT-PCR试剂盒购自美国Gibco BRL公司。
1.2 实验动物 选用健康雄性SD大鼠72只（由温州医学院动物中心提供），体重200～250g，22℃恒温房内饲养，标准颗粒混合饲料（由温州医学院动物中心提供）喂养，自由饮水。
1.3 实验分组与给药 72只SD大鼠随即分为3组（每组24只），分别为：正常对照组、内毒素模型组、乌司他丁治疗组，每组又随机分为4个小组（每组6只），分别为6h、12h、24h、48h 4个时间点。通过腹腔注射LPS 4μg/kg（10g/L）,D-Gal 800mg/kg（250g/L）建立急性肝衰竭模型，治疗组在建立模型前30min先给予腹腔注射UTI 10u/kg（5u/ml）。正常对照组给予等量生理盐水。
1.4 标本采集 分别于给药后各个时间点处死各组大鼠，切皮开腹，下腔静脉取血，迅速取出肝脏，以液氮冻存。部分肝脏浸泡于体积分数为4%多聚甲醛溶液48h后，进行石蜡包埋、切皮、HE染色。
1.5 检测指标 （1）肝功能：血液离心后血清送本院生化室检测ALT、AST。（2）苏木素-伊红（HE）染色，观察肝脏病理改变。（3）ELISA法检测血清中TNF-α和IL-6含量，按ELISA试剂盒说明书操作。（4）PPAR-γ mRNA表达的测定：肝组织总RNA采用TRIzol一步法提取，经紫外分光光度计测定各总RNA的吸光度（A260）值，根据PPAR-γ的cDNA文库进行引物设计，合成，上游引物为5’-TGAAACTCTGGGAGATCCTCC,下游引物为5’-ACAAGTCCTTGTAGATCTCCTGGA,预计扩增产物长度为193bp，以特异性引物反转录合成cDNA，再以其为模板进行扩增PPAR-γ基因片段和琼脂糖凝胶电泳，经凝胶密度扫描系统处理，测定各电泳带灰度值，计算各组PPAR-γ mRNA相对表达量。
1.6 统计学分析 实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0软件进行方差分析t检验，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 UTI对急性肝衰竭大鼠血清肝功能ALT、AST结果 模型组与正常组比较，ALT、AST明显增高，LPS和D-Gal可诱导大鼠内毒素急性肝损伤，UTI治疗组可明显改善以上肝功能指标，治疗组和模型组比较差异有显著性（P<0.05）。见表1、表2。表1 血清ALT的变化 注：与同时间点正常组比较，*P<0.05；与同时间点模型组比较，#P<0.05表2 血清AST的变化 注：与同时间点正常组比较，*P<0.05；与同时间点模型组比较，#P<0.05
2.2 HE染色 随着内毒素作用时间的延长，病理损害逐渐加重，12h达到顶峰，随后开始减轻。模型组肝组织呈弥漫性病变，肝细胞浊肿，变大，有脂质沉积，可见点灶状坏死，肝小叶完整，局部有炎细胞浸润，治疗组肝组织病理改变明显轻于模型组。见图1～3。
2.3 UTI对内毒素急性肝衰竭大鼠血清TNF-α的影响 模型组TNF-α含量较正常组明显升高，差异有显著性，6h即达顶峰，治疗组TNF-α含量较模型组有明显降低，差异有显著性（P<0.05）,见图4。图1 正常组HE染色 图2 模型组HE染色 图3 乌司他丁治疗组HE染色图4 UTI对各组大鼠TNF-α水平的比较注：与同时间点正常组比较，*P<0.05；与同时间点模型组比较，#P<0.05
2.4 UTI对急性肝衰竭大鼠血清IL-6的影响 模型组IL-6含量较正常组明显升高，差异有显著性，6h即达顶峰，治疗组IL-6含量较模型组有明显降低，差异有显著性（P<0.05）,见图5。
2.5 UTI对各组大鼠肝脏PPAR-γ mRNA表达的影响 根据电泳图灰度值计算出各组大鼠肝脏PPAR-γ mRNA的表达量。由表3示，模型组大鼠肝组织PPAR-γ mRNA的水平显著低于空白对照组（P<0.01）；UTI治疗组PPAR-γ mRNA的水平显著高于模型组（P<0.05），见表3。表3 各组大鼠肝脏组织中PPAR-γ mRNA表达量比较 注：与同时间点正常组比较，*P<0.05；与同时间点模型组比较，#P<0.05图5 UTI对各组大鼠IL-6水平的影响注：与同时间点正常组比较，*P<0.05；与同时间点模型组比较，#P<0.05
3 讨论
脂多糖（LPS）是G-菌细胞外壁的一种糖脂复合物成分，LPS通过刺激体内多种细胞，合成和释放各种细胞因子，再作用于其他组织细胞，可引起全身炎症反应综合征［7］。动物经D-Gal致敏后可增强对内毒素的敏感性及肝脏器官损害特异性［8］。本实验通过D-Gal联合脂多糖（LPS）腹腔注射方法建立的急性肝衰竭动物模型，死亡率高，给药6h肝功能显著升高，肝脏病理出现显著病变，肝小叶内可见灶状和小片状坏死伴炎症细胞浸润，符合急性肝衰竭表现。而UTI作用后，肝功能好转，病理改变明显减轻，显示UTI对急性肝衰竭有一定的保护作用。
乌司他丁是一种广谱的酶抑制剂，可抑制磷脂酶A2、胰淀粉酶、弹性蛋白酶及纤溶酶等活性，同时可稳定溶酶体酶，抑制心肌抑制因子的产生。大量研究证实，乌司他丁能抑制炎症介质的过度释放，改善微循环、组织灌注、调控全身炎症反应等。但是乌司他丁对感染性休克的作用机制尚不完全清楚，本研究主要通过观察乌司他丁作用下，从PPAR-γ以及其他细胞因子变化的角度来探讨乌司他丁对急性肝衰竭的保护作用。
已有研究表明，急性肝功能衰竭严重程度及预后和细胞因子关系密切，TNF-α是造成肝损伤的主要细胞因子［9］，IL-6能抑制肝细胞再生［10］。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是一类能被过氧化物酶体增殖物激活的核内受体，由三个亚家族PPARα、PPARβ/δ、PPARγ组成，该受体家族主要在脂质代谢、脂肪分化中起作用［11］。其中PPARγ主要表达于脂肪组织、免疫组织、肝脏组织、肌肉组织［12］。参与炎症、免疫反应的调节，在炎症反应中，PPARγ可通过竞争抑制炎症信号通路和炎症介质的生成如C反应蛋白等，从而起到抑制炎症反应的作用［13］。
本研究结果发现，模型建立后，肝组织中PPAR-γ mRNA水平明显降低，而乌司他丁可以使急性肝衰竭小鼠的PPAR-γ mRNA表达增加，而其他损伤性炎症介质如TNF-α、IL-6，应用乌司他丁干预后，其血清水平较模型组明显降低。这一结果提示乌司他丁可以拮抗内毒素休克引起的肝损伤，这种保护作用可能是通过调节肝组织PPARγ表达以及其他炎症因子的释放引起。
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（编辑：余 强）
作者单位：1 325000 浙江温州，温州医学院（2006级硕士研究生） 2 325000 浙江温州，温州医学院附属第一医院感染科