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【摘要】 在肿瘤综合治疗中，生物治疗越来越受到重视，已成为继手术、化疗、放疗三大常规治疗之后的第四模式。本文基于生物治疗的最新进展，提出抗肿瘤入侵(anti-tumor invasion)、抗肿瘤血管生成(anti-tumor angiogenesis)、抗肿瘤干细胞治疗(anti-tumor stem cells)、杀伤肿瘤细胞(anti-tumor cell)、提高抗肿瘤免疫(anti-tumor immunity)五法综合应用的抗癌策略，以提高生物治疗的疗效，即“5A生物疗法”。研究表明，小牛软骨蛋白含有多种抗癌活性因子，至少具有以上5种抗肿瘤活性，是一种天然的综合生物疗法制剂，具有很好的研究应用前景。
【关键词】 5A生物疗法;小牛软骨;抗癌
In comprehensive treatments of the tumor, bio-therapy is receiving more and more attentions, has become the fourth mode of tumor treatment after the surgery, chemotherapy and radiotherapy. This article analyzed today’s hot spots on biological research of treatment of tumor and proposed a comprehensive anti-tumor biotherapy: anti-tumor invasion, anti-tumor angiogenesis, anti-tumor stem cells, anti-tumor cells and anti-tumor immunity. Comprehensive application of those five anti-cancer strategies is to enhance the efficacy of biological treatment, namely 5A biotherapy. Studies have shown that bovine cartilage contains a variety of anti-cancer protein factors, at least five or more anti-tumor activities, and is a comprehensive natural bio-therapy agent with good prospects in further research and application.
[Key words] 5A-biotherapy; calf cartilage; anti-tumor
据WHO最新统计数据显示，恶性肿瘤正加速成为世界的“头号杀手”。2003年至今，全球每年纯增1090万恶性肿瘤病人，几乎比7年前翻番。而我国卫生部最近也公布恶性肿瘤已成为中国城乡居民的主要死亡原因。应对恶性肿瘤的凶猛攻势，单靠追求某种抗癌药物的突破已不能满足形势需求，积极思考并探索肿瘤治疗的新策略才是正确的出路。
在肿瘤综合治疗中，生物治疗已经成为继肿瘤手术治疗、放射治疗和化学治疗三大常规治疗之后的第四种模式，而且越来越受到重视，并在37～45届ASCO和第7～11届CSCO年会上成为最令人瞩目、最鼓舞人心的焦点。自20世纪80年代中叶，Bosenberg和Oldham等[1]初步建立现代肿瘤生物治疗的理论和技术，国内外对肿瘤生物疗法的研究越来越多，越来越深入。
1 肿瘤生物治疗的综合策略：“5A生物疗法”
肿瘤生物治疗由于针对性强、效果专、毒副作用小，被视为当今一种绿色的肿瘤治疗方式，并在晚期癌症以及不适合手术放化疗的癌症患者中取得了卓越的成效。但是，肿瘤的发生发展机制极其复杂,单靠某一类抗肿瘤生物制剂往往难以获得理想疗效。面对复杂的肿瘤，生物治疗也应采取多靶点、多途径的综合治疗策略。为此，我们提出从以下5个层面共同治疗肿瘤的“5A生物疗法”策略：
首先，要阻止肿瘤的侵袭和转移，即抗肿瘤入侵(anti-tumor invasion)。肿瘤细胞要入侵和转移，必须克服宿主组织的结构障碍，这些障碍由细胞外结构大分子复合体如胶原蛋白、蛋白多糖、糖蛋白和弹性蛋白等形成的网状结构组成[2]。而肿瘤细胞在入侵时，会释放入侵因子，这些入侵因子会打破正常组织的“免疫防护”形成新生血管的开口。
第二，要阻止肿瘤的继续生长，可通过抗肿瘤血管生成(anti-tumor angiogenesis)来实现。有功能性血供是肿瘤生长及转移的关键，如果没有血管系统提供氧气和养料，实体瘤的增长不会超过2mm3[3]。肿瘤细胞诱导的新生血管结构存在缺陷，分布方式无序，也无完整的微循环功能，与宿主正常组织的血管存在较大差异，属于未分化成熟的血管。肿瘤新生血管越多，肿瘤生长增殖越快，发生转移的概率就越高。肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的关键，调节肿瘤血管的生长就可能控制肿瘤的生长。
第三，要靶向抑杀决定肿瘤生长的祖细胞，即抑杀肿瘤干细胞(anti-tumor stem cells)。目前临床上对肿瘤的治疗都是针对处于增殖阶段的肿瘤细胞。虽然肿瘤能达到消退或缓解, 但往往在一段时间后会复发，这是肿瘤患者5年生存率低的主要原因[4]。由于肿瘤干细胞同正常干细胞一样,处于相对静止状态，多处于G0期，而大多数细胞毒药物治疗癌症的靶点都是处于S、M或G2期的细胞，所以肿瘤干细胞可以逃避药物的杀伤作用，在传统的针对增殖性肿瘤细胞的各种治疗中得以存活。即使99.99%的肿瘤细胞已被消灭，但这0.01%的细胞却继续存活而成为复发的根源。大量的观察和研究结果已证明，肿瘤干细胞的存在是肿瘤发生、发展、耐药及复发的根本原因[5]。
第四,靶向杀灭残存的肿瘤细胞，即杀灭残余肿瘤细胞(anti-tumor cell)。肿瘤细胞具有无限增殖、易分散和转移的特性。因此即使通过手术、放化疗等大面积灭杀后，只要有残余癌细胞，就有可能复发。所以在肿瘤生物综合治疗中，须联合直接抑杀肿瘤细胞的生物制剂，清除残余的肿瘤细胞。
第五，要增强机体的抗肿瘤免疫(anti-tumor immunity)，机体的免疫功能与肿瘤的发生有密切关系，当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发生率增高。通过激活自身免疫系统，提高抗肿瘤免疫，可以有效降低肿瘤患者术后复发与转移的几率。
抗肿瘤入侵(anti-tumor invasion)、抗肿瘤血管生成(anti-tumor angiogenesis)、抑杀肿瘤干细胞(anti-tumor stem cells)、杀灭肿瘤残余细胞(anti-tumor cell)、抗肿瘤免疫(anti-tumor immunity)五法综合应用，可概括为“5A生物疗法”(5A-Biotherapy)，从五个方面入手，攻防结合，局部与整体兼顾，在靶向杀伤肿瘤的同时，又防止肿瘤的扩散、转移和复发，符合肿瘤的发生发展规律。
2 小牛软骨抗癌活性因子与“5A生物疗法”
小牛软骨(calf cartilage)是一种高度特异化的致密结缔组织，属无血管组织，主要由软骨细胞和含有胶原纤维及大量蛋白多糖的细胞外基质构成，其显著特点是软骨在胚胎发育时期形成的血管在个体出生后自动消失[6]。经研究发现，小牛软骨对肿瘤组织的侵蚀具有一定的抵抗性。同时还发现，小牛软骨的粗提物能抑制多种恶性肿瘤的生长[7]。
自从20世纪70年代，人们就开始研究小牛软骨中的抗癌活性成分及其作用机制[8]。根据目前的报道小牛软骨的抗癌活性成分主要包括3类：一类称为血管生成抑制因子(cartilage angiogenesis inhibiting factor, CAIF)，为小分子的多肽或糖蛋白，在体外能抑制血管内皮细胞的增殖与迁移，在体内可通过抑制新生血管生成来抑制肿瘤细胞的生长。第二类称为抗肿瘤因子(cartilage anti-tumor component ,CATC)。第三类为抗肿瘤入侵因子(cartilage anti-tumor invasion,CATI)，是一类小分子蛋白，具有蛋白酶、EC增殖和肿瘤细胞生长抑制活性，因而能抵抗多种细胞(如血管EC和恶性肿瘤性细胞)的入侵。
2.1 小牛软骨抗癌活性因子的抗癌机制研究
2.1.1 抗血管生成 抗肿瘤血管生成是小牛软骨活性蛋白抗癌作用的主要机制之一。1976年，Langer等[9]首次从小牛肩胛软骨中初步分离得到CAIF，该因子具有很高的胰酶和血管生成抑制活性。1990年，Mose等[10]从牛软骨中分离纯化出一蛋白质CDI，发现其除了具有明显的胶原酶抑制活性外，还有很高的胰酶抑制活性，并能抑制体外血管EC的增殖、迁移和体内血管生成，上述活性在提纯的过程中随提纯的纯度而增强。1992年，沈先荣等[11]发现纯化电泳得到的CAIF对EC的增殖、迁移和DNA合成均有较强的抑制作用，且电镜下显示该因子能抑制血管内皮细胞骨架的形成。此外,CAIF对血管内皮细胞的DNA合成具有非常显著的抑制效应，且实验证明可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生长[12]。诸多研究揭示，小牛软骨抗血管生成的机制可能是通过抑制血管内皮细胞骨架的形成，抑制血管内皮细胞的分裂增殖及其运动迁移，并对EC产生明显的细胞毒作用，从而抑制新生血管的形成，抑制肿瘤的生长和转移。
2.1.2 抑杀肿瘤细胞 小牛软骨不仅可以通过抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤，还有对直接抑杀肿瘤细胞。1984年，Suzuki等[13]首次粗提得到CATC，发现其能抑制体内实体瘤S-180的生长。此后，Taki-gawa等[14]继续研究发现，CATC能特异性地抑制EC的增殖及DNA的合成，并能抑制肿瘤的生长及由肿瘤引发的血管生成。沈先荣等发现CATC可明显抑制TC的生长及DNA合成，其抑制程度随时间的延长而增强。Morioka等也发现CATC对肿瘤的生长和转移以及血纤维蛋白溶酶原活化因子的产生表现出强抑制活性。沈先荣等[15]发现鲨鱼软骨与牛软骨的粗体物性质十分相似，而且能使肿瘤细胞的细胞骨架发生凝聚或固缩，并有明显的浓度依赖关系，具有一定的抗TC增殖活性，并且表现出细胞毒性。这些都证明小牛软骨可直接抑杀肿瘤细胞。其作用机制可能是：通过使肿瘤细胞骨架发生凝聚或固缩，抑制血纤维蛋白溶酶原活化因子、肿瘤细胞DNA的合成，对肿瘤细胞产生细胞毒作用，从而抑杀肿瘤细胞，控制肿瘤的生长及转移。
2.1.3 抑杀肿瘤干细胞 我们已知道，肿瘤干细胞是肿瘤细胞群中具有类似干细胞特性的细胞群，具有自我更新和高度增殖的能力。因此，在根除肿瘤干细胞之后，肿瘤整体的增殖能力急剧下降，即使其他的非肿瘤干细胞未被杀灭,由于其增殖能力有限，也可能在增殖若干代之后使肿瘤逐渐退化萎缩。因此，抑杀肿瘤干细胞被可望有效提高肿瘤患者5年生存率，并有可能从根本上治疗癌症。研究发现，小牛软骨可直接抑杀肿瘤干细胞。Durie等[15]利用小牛软骨粗提物进行人肿瘤干细胞实验，发现其对肿瘤干细胞有抑制作用。沈先荣等[11]发现小牛软骨粗提物抗肿瘤组分CATC还可显著抑制肿瘤干细胞生长，其抑制程度也随作用时间的延长而增强，而且对不同肿瘤干细胞的抑制程度不同。但目前对小牛软骨抑制肿瘤干细胞机制尚无报道。
2.1.4 抗肿瘤入侵 动物软骨中具有抵抗多种细胞(如血管EC的恶性肿瘤细胞)入侵的特性。Sorgent等研究发现小牛软骨提取物加入培养基后，具有抵抗肿瘤细胞入侵的活性。Kuettner等[16]首先从牛鼻中隔软骨中初步得到CATI，具有胰酶和胶原酶抑制活性。Wezeman和Childs[17]用NaCl抽提软骨并超滤，得到抗肿瘤入侵因子粗提物，具有抑制胰酶、胰凝乳蛋白酶和抗原酶等多种蛋白水解酶的活性。Kuettner和Pauli[16]还发现软骨来源的抗入侵因子具有天然金属蛋白酶抑制活性。经研究发现，软骨抗肿瘤入侵多通过抑制蛋白酶活性、体外血管EC增殖活性、肿瘤生长活性起到抗肿瘤入侵的作用。由于抗肿瘤入侵因子在分子大小的生物活性上与CAIF十分相似，推测可能是同一类物质，但并没有确切的证据，需要进一步研究验证。
2.1.5 抗肿瘤免疫 沈先荣等[11]研究发现，小牛软骨中提取CATC还能明显增加给药小鼠胸腺的重量，提示可能具有免疫调节的作用;提取的CAIF还有刺激小鼠骨髓细胞的DNA合成，因而认为可能对造血系统有促进作用。这些研究都说明小牛软骨具有增强抗肿瘤免疫的功效，也可认为是抗肿瘤作用的机制之一。
2.2 “5A生物疗法”与小牛软骨抗癌活性因子 肿瘤生物治疗是当今国际上研究的热点之一，每年都有许多天然的或人工合成的抗肿瘤生物制剂被人们发现。但目前的生物疗法多是针对肿瘤生成、发展的单个过程或者途径的，而肿瘤的发生是复杂的，应多途径、多靶点对肿瘤进行综合生物治疗。小牛软骨抗癌活性因子是一组天然无毒的抗癌生物活性物质。国内外对其抗癌作用有大量的研究，从文献报道看，小牛软骨抗癌活性因子能够从抗肿瘤入侵(anti-tumor invasion)、抗肿瘤血管生成(anti-tumor angiogenesis)、抑杀肿瘤干细胞(anti-tumor stem cells)、杀灭肿瘤残余细胞(anti-tumor cell)、抗肿瘤免疫(anti-tumor immunity )五个方面治疗肿瘤，可以作为肿瘤“5A生物疗法”的载体，具有良好的研究应用前景。
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15 Durie BG, Soehnlen B, Prudden JF.Anti-tumor activity of bovine cartilage extract (Catrix-S) in the human tumor stem cell assay.Biol Resp Modif,1985,4:590.
16 Kuettner KE,Pauli BU. Primary invasion:natural inhibitors. Dev Oncol,1983,15:15.
17 Wezeman FH,Childs GV. Ultrastructural immunohistochemical localization of anti-invasion factor in bovine cartilage matrix.J Histochem Cytochem,1982,30(6):524.