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【摘要】 目的 观察不同的CT-1C-末端多肽干预方式对大鼠心肌缺血再灌注损伤后血浆NO及红细胞ATP含量的变化。方法 用结扎-松解SD大鼠冠状动脉左后降支的方法制作MI/R模型。27只SD大鼠随机分为4组：正常组(N，n=5);缺血再灌注组(D，n=6)，MI 30min后开始再灌注;MI/R后干预组(T，n=8)，MI 30min后开始再灌注并腹腔注射CT-1C-末端多肽100μg/kg;MI/R前干预组(O，n=8)，腹腔注射CT-1C-末端多肽100μg/kg后进行MI/R实验。动物实验结束时取血检测血浆NO和红细胞ATP含量。结果 MI/R后，SD大鼠血浆NO浓度降低(N vs D，P<0.01)，红细胞ATP含量与正常组之间无明显差别(N vs D，P>0.05);MI/R后施加CT-1C-末端多肽干预，SD大鼠血浆NO浓度升高(T vs N，P<0.01)，红细胞ATP含量也明显升高(T vs N，P<0.05; T vs D，P<0.01);MI/R前施加CT-1C-末端多肽干预7天，再进行MI/R实验，SD大鼠血浆NO浓度高于正常组(O vs N，P<0.01)，但低于MI/R后干预组(O vs T，P<0.01)，红细胞ATP含量与正常组、疾病组比较差异无显著性(均P>0.05)。4组动物中，只有MI/R前干预组的大鼠血浆NO浓度与红细胞ATP含量之间存在显著相关(γ=0.7075，P<0.05)。结论 CT-1C-末端多肽短期作用能使大鼠MI/R后血浆NO和红细胞ATP含量明显升高，但慢性长期作用后，则使血浆NO和红细胞ATP含量升高程度降低。
【关键词】 CT-1C-末端多肽;缺血再灌注损伤(MI/R);一氧化氮(NO);三磷酸腺苷(ATP)
Effects of different scheme exerted by cardiotrophin-1C-terminal peptides on erythrocytes ATP in SD rats following myocardial ischemia reperfusion injury
CHEN Shu-fen, YAO Zhen, ZHANG Xiao-fang.Hainan Medical College, Haikou 570102，China
Objective To observe the effect of cardiotrophin-1C-terminal polypeptides administered before and after ischemia on erythrocytes ATP after acute ischemia reperfusion in SD rats. Methods The ischemia reperfusion heart model was established by ligating/loosening the left posterior descending coronary artery in SD rats. Matched pairs of SD rats were treated with CT-1C-terminal polypeptides either before or after myocardial ischemia, and the plasma NO level and erythrocytes ATP content were examined. Results The erythrocytes ATP content did not changed in the ischemia reperfusion group (D vs N and O vs N, P>0.05), but increased significantly in post-ischemia group (P<0.01). The plasma NO level were decreased significantly in the ischemia reperfusion group (P<0.01). It increased remarkably in the post-ischemia group (P<0.01) and increased moderately in the pre-ischemia group (P<0.01). The significant correlation between plasma NO level and erythrocytes ATP content only existed in the rats of post-ischemia group (γ=0.7075, P<0.05). Conclusion Carditrophin-1C-terminal polypeptides administered at the same time of reperfusion can induce the erythrocytes ATP content and plasma NO level increasing in SD rats following myocardial ischemia reperfusion injury, but attenuate the increasing degree of these profile when it is administered chronically before myocardial ischemia reperfusion injury.
[Key words] carditrophin-1C-terminal polypeptides; ischemia reperfusion injury (MI/R); NO; ATP
心肌遭受缺血再灌注损伤时，自由基产生增多，可使线粒体膜发生脂质过氧化，造成线粒体结构和功能受损，表现为氧利用障碍，ATP合成减少。因此，在恢复心肌再灌注的同时，增加ATP的供应，对于心肌收缩功能的恢复将有积极的意义。CT-1可以使肺组织和主动脉中内源性一氧化氮合酶(iNOS)表达增加[1]，使NO产生增多。而NO可激活糖酵解过程中的相关酶[2]，与红细胞的ATP合成与释放有关。本研究选取大鼠CT-1C末端的16个氨基酸合成多肽，于SD大鼠遭受MI/R损伤前、后两种情况下进行干预，观察CT-1C-末端多肽的作用后，大鼠红细胞ATP含量的变化，及其与血浆NO浓度变化之间的关系，进而探讨CT-1C-末端多肽对MI/R后机体能量代谢的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料及仪器 选取大鼠CT-1C-末端第187～203号16个氨基酸,序列为SRTEGDLGQLVPGGVA,由上海SANGON生物工程公司合成,分子量为1556.0。还原型辅酶I-Na(NADHNa)，磷酸甘油激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶和氮蓝四唑为Sigma公司产品，其余试剂均为分析纯。
ECG-6511型心电图机、TKR-200C型小动物呼吸机、UNIVERSE-R32低温冷冻离心机、普通离心机、752-紫外可见分光光度计。
1.2 实验动物与分组 SD大鼠27只，雌雄不限，体重200～300g(购自同济医科大学实验动物中心)，随机分为4组，N组为正常组(n=5)，不进行冠脉结扎和松解实验;D为缺血再灌注组(n=6)，结扎冠脉30min后，松解冠脉开始再灌注;T组为MI/R后干预组(n=8)，结扎冠脉30min后，松解冠脉开始再灌注并腹腔注射CT-1C-末端多肽100μg/kg;O 组为MI/R前干预组(n=8)，腹腔注射CT-1C-末端多肽100μg/kg 7天后，进行冠脉结扎和松解实验。
1.3 心肌缺血再灌注损伤模型的制备 1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，颈部居中切开，暴露气管，剪开气管，插入气管插管并小动物呼吸机相连。设置好各项参数，压力0.6mPa，频率30次/min，潮气量2.5ml/100g。同步记录心电图，观察ST变化。沿胸骨左缘切开皮肤，分离皮下软组织，紧贴胸骨左缘切断2～5肋，打开胸腔、暴露心脏，找到冠状动脉左后降支，于其中、上1/3交界处以无创缝合线贯穿结扎冠状动脉(打活结)，以心电图Ⅱ导联ST下降50%及心脏表面颜色变成紫黑色为结扎成功的标志，造成急性心肌缺血，30min后松解结扎线使冠状动脉再通形成再灌注，以抬高的ST段出现下降1/2以上为再灌注成功。按各组动物的实验方案，施加CT-1C-末端多肽干预，于动物濒死前结束实验，从主动脉抽取血样测定各项指标。
1.4 血浆NO浓度测定 用预冷的EDTA-Na2和抑肽酶抗凝管收集血液2ml，4℃，1000r/min，离心30min，分离血浆和血细胞。取血浆1ml，加入0.1% N-(1-萘基)-乙二胺和1% 对氨基苯磺酸等体积混合液1ml，室温反应10min，550nm测其吸光度，并计算NO的浓度。
1.5 红细胞ATP含量测定 用上步分离的血细胞，取最下层的红细胞10μl，注入含2ml红细胞稀释液的试管中，充分摇匀，然后用90℃ Tris-EDTA缓冲液按9:1的比例稀释之，并在沸水中水浴1.5min,冷却后过滤,取滤液1.0ml，加入1ml 1mM 还原型辅酶I-Na(NADHNa)，40μl 5.88u/μl磷酸甘油激酶[含3.0M (NH)2SO4,0.04M 焦磷酸钠和0.02M 的氮蓝四唑)]和1mg/ml 3-磷酸甘油醛脱氢酶(0.1M的柠檬酸缓冲液)的混合液,置25℃水浴30min,340nm测其吸光度，并计算ATP含量。
1.6 统计学分析 实验数据均以x±s表示，多组间比较用方差分析，多组间两两比较用q检验，相关性分析用直线相关分析。
2 结果
2.1 MI/R后各组大鼠平均存活时间 MI/R后各组SD大鼠的平均存活时间为(93.17±24.7)min，于再灌注同时注射CT-1C-末端多肽的MI/R后干预组动物，存活时间明显长于缺血再灌注组(q值为3.171，P<0.05)和MI/R前干预组(q值为3.716， P<0.05)，见表1。表1 MI/R后SD大鼠平均存活时间
2.2 MI/R后SD大鼠血浆NO浓度变化 结扎大鼠冠状动脉左后降支30min，再灌注1.5～2.5h内，3组动物的血浆NO浓度均发生了明显变化，其中疾病组大鼠的血浆NO浓度明显降低(与N组比较，P<0.001)，而再灌同时接受CT-1C-末端多肽腹腔注射的T组大鼠，血浆NO浓度明显升高(与D组比较，P<0.01)，并明显超过正常组(与N组比较，P<0.01)。连续给SD大鼠腹腔注射CT-1C-末端多肽7天后，再进行MI/R实验，其血浆NO浓度虽然明显高于疾病组和正常组，但升高程度明显低于MI后干预组(P<0.01)。见表2。表2 MI/R后SD大鼠血浆NO浓度、血红细胞ATP含量的变化
2.3 MI/R后大鼠红细胞ATP含量变化 MI/R后4组SD大鼠的红细胞ATP含量也存在明显差别，疾病组大鼠MI/R后红细胞ATP含量有所升高，但与正常组比较，差异无显著性(P>0.05)。在心肌缺血30min，再灌注同时腹腔注射CT-1C-末端多肽的T组大鼠红细胞ATP含量则明显升高(与D组比较，P<0.01)。而连续接受CT-1C-末端多肽腹腔注射7天后的SD大鼠，再进行MI/R实验，其红细胞ATP含量虽然明显高于疾病组和正常组，但升高程度明显低于MI后干预组(P<0.01)。
2.4 MI/R后大鼠血浆NO浓度与红细胞ATP含量变化的相关性 本次实验，4组动物中，只有MI/R前干预组的大鼠血浆NO浓度与红细胞ATP含量之间存在显著相关(γ=0.7075，P<0.05)。
3 讨论
在急性心肌梗死时,尽早恢复缺血心肌的再灌注，目的就在于给受损的心肌提供充分的氧气和能量供应。研究表明，血液中的红细胞，不仅有携带和运输氧气的功能，而且具有在缺氧条件下扩张血管的功能[3]，这对于维持心肌细胞的收缩功能，改善预后显然有着很重要的意义。至于其机制，目前认为与NO和ATP有关。本实验中，笔者于SD大鼠心肌缺血30min后，恢复再灌注的同时，给予CT-1C-末端多肽干预后，动物MI/R后的存活时间明显延长，其血浆NO浓度和红细胞ATP含量也明显升高。NO是很活泼的小分子，有很强的扩血管作用及广泛的生物学活性，红细胞和血管内皮都可以将亚硝酸盐转变为NO[4],血液中的多种成分，如血红蛋白、白蛋白和谷胱甘肽都可以携带和释放NO[5]，而且血液能将上游血管产生的NO转移到下游的阻力血管，从而改善组织微循环的灌注情况[5]。此外，NO还与红细胞ATP的产生与释放有密切关系。曾有研究报告，NO既可以通过内源性红细胞单-ADP-糖基转运酶(mono-ADP- ribosyltransferase)来调节ATP的释放[2]，也可以通过G-蛋白相关的信号转导途径中腺苷环化酶V型、IV型的S-亚硝基化而抑制ATP的释放[6]。成熟红细胞没有细胞器，其ATP的生成主要来自无氧酵解，NO可激活糖酵解过程中的相关酶[2]。本实验的结果表明，大鼠遭受缺血再灌注损伤后，红细胞ATP含量的变化与血浆NO浓度的变化有一定的关系，疾病组大鼠血浆NO浓度很低，其红细胞ATP含量也较低，于再灌注同时腹腔注射CT-1C-末端多肽，血浆NO浓度明显升高时，红细胞ATP含量也达本组实验的最高水平，而大鼠经当CT-1C-末端多肽作用7天后，其MI/R损伤后的血浆NO浓度上升程度降低时，红细胞ATP含量升高程度也下降，表明NO对于红细胞ATP有一定的刺激作用,但4组动物中,只有MI/R前干预组的大鼠血浆NO浓度与红细胞ATP含量之间存在显著相关,除了与此次实验的样本数量偏少有关外,NO与红细胞ATP合成与释放之间并非简单剂量-效应关系,应该还存在更复杂的机制。近期则有研究认为，NO的前体物质亚硝酸盐能修饰血红蛋白，后者与红细胞膜结合增加，并取代了膜上的糖酵解酶，导致红细胞中的ATP释放出来。而ATP则可与血管内皮上的嘌呤受体作用，激活内皮型一氧化氮合酶(iNOS)，使NO的合成增加[7]。由此可见，缺血时血浆中NO浓度的变化受多种因素的影响，而ATP之间是否存在相互反馈的调节作用，还需要进一步的阐明。
文献报道[1]，CT-1可以使肺组织和主动脉中内源性一氧化氮合酶(iNOS)表达增加，使NO合成增多。本实验结果显示，血浆NO浓度增高时，红细胞ATP含量也增加，推测其原因可能在于，CT-1C-末端多肽激活了组织中的iNOS，使NO生成增加，NO又通过某种机制使红细胞ATP的合成与释放增加。但是SD大鼠接受7天腹腔注射CT-1C-末端多肽后，再进行MI/R实验，其血浆NO浓度和红细胞ATP含量都明显低于MI/R后接受CT-1C-末端腹腔注射的动物，其确切机制尚不清楚。CT-1的一个显著作用就是促心肌细胞肥大[8]，但CT-1的作用并不仅仅局限于心肌细胞，它对其他组织细胞也有影响,如：CT-1缺失可以导致节前交感神经和肾上腺髓质发育缺陷[9]，它可以诱导脐静脉内皮细胞合成MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)[10]，也能诱导单核细胞合成IL-6[11]，并且能在脂肪组织和肝脏中表达[12，13]，这表明，CT-1对机体的多个器官功能及生物合成过程有着广泛的影响。根据此实验的结果，笔者认为，CT-1是通过NO介导影响红细胞ATP的合成与释放，但CT-1对红细胞ATP合成与释放的相关酶系有何影响，特别是CT-1长期慢性作用后，机体NO合成体系及红细胞ATP合成体系如何变化，这些变化对心肌细胞能量产生和利用会发生怎样的影响等等，还有待于进一步地研究。
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