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【摘要】 目的 应用LacZ基因报告系统明确白念珠菌相转换特异基因HYR1上游脯氨酸相关的启动子片段。方法 采用PCR、基因重组、酵母转化和报告基因测活，比较不同HYR1基因上游1800bp内不同片段的启动子活性。结果 -400~-200bp区域存在启动调控活性，其他区域未见相关的启动活性。结论 在HYR1基因上游-400~-200bp间存在与脯氨酸相关的基因调控元件，β-半乳糖苷酶（LacZ）报告基因系统可以用来研究白念珠菌基因调控活性。
【关键词】 白念珠菌；脯氨酸；基因
Application of LacZ as reporter gene to research on promoter activity of candida albicans yeast-hyphal shift gene（HYR1）
CHEN Jiang-han,WANG Xiao-jun,XU Hong,et al.
Department of Dermatology,Changzhen Hospital,The Second Military Medical University，Shanghai 200003,China
【Abstract】 Objective With PNG17（LacZ） as reporter gene to clarify the fractional activity of promoters concerned with proline from candida albicans yeast-hyphal regulation gene（HYR1）.Methods Sequence between 1800bp upstream of the start of transcription and 43bp downstream of this site was investigated with serial 5′-deletion,the 5′-deletion promoters were recombinted with vector PNG17（LacZ） as reporter gene and the constructs were transiently transformed EGY48 yeast.Results -400~-200bp of candida albicans HYR1 gene had activity as promoter.Conclusion In the region of -400~-200bp of candida albicans HYR1 gene,there was regulatory element concerned with proline.PNG17（LacZ） as reporter gene is practicable.
【Key words】 candida albicans;proline;gene
白念珠菌是最重要的致病真菌，其基因组计划已经完成，越来越多的基因的功能和定位被阐明。然而由于缺乏合适的报告系统，相关基因，特别是一些重要基因的调控机制仍未明确，因此迫切需要找到恰当的报告基因。HYR1基因已被证明是白念珠菌菌相转换的特异基因［1］，脯氨酸是菌丝生长重要的诱导者,HYR1基因上游是否存在其顺式调控元件、它们的分布如何等这些问题尚无研究报道。本文应用含β-半乳糖苷酶（LacZ）报告基因的质粒PNG17与HYR1基因启动子（-1800~+43bp）组成的重组体，及酵母转化技术，逐段研究HYR1基因上游脯氨酸相关的启动子序列。
1 材料与方法
1.1 菌株和培养条件 白念珠菌为ATCC10261。白念珠菌在YEPD培养基中（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母抽提物）培养至指数生长后期，按标准的酵母菌DNA抽提法分离染色体DNA以用作模板。
1.2 研究及对照片段的选择 对HYR1基因上游1.8kb左右的序列进行了研究，根据DNA ssist 2.0软件的分析结果，分段克隆了不等长的片段，它们分别是HYR1基因转录起始位点上游200bp、400bp、600bp，1000bp、1400bp、1800bp等,见图1。
1.3 报告系统的应用 载体PNG17是大肠杆菌、酵母菌的穿梭质粒，带有β-半乳糖苷酶（LacZ）报告基因，但基因上游没有启动元件。PNG17为Terrance G.Cooper教授（Department of Microbiology and Immunology,University of Tennessee）所赠，质粒图谱如图2。
图1 克隆片段示意图（略）
图2 PNG17质粒图谱（略）
1.4 重组体的构建 重组体中所含的启动子即是所要研究的白念珠菌菌相转换基因HYR1转录起始位点上游的各个大小不同的DNA片断。它们具有相同3′端，分别对应于HYR1基因上游-1800~+43bp,-1400~+43bp,-1000~+43bp,-600~+43bp,-400~+43bp,-200~+43bp，来自于以白念珠菌ATCC10261染色体DNA为模板的PCR扩增产物，相应的重组体分别命名为pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2。启动子5′端引物序列分别为：pHYR1.8：5′-CCGTCGACCCAATTCCCCCATTAGAACAC-3′; pHYR1.4：5′-CCGTCGACTTGGTTATGAACACTGCAACT-3′;pHYR1.0：5′-CCGTCGACAGAAAGGGAAAGGCGTGTAAGG-3′;pHYR0.6：5′-CCGTCGACCACGAATACAATGGGAACACGA-3′;pHYR0.4：5′-CCGTCGACGGCAAATGCTTAGTATGACAGC-3′;pHYR0.2:5′-CCGTCGACCACACGCCTATTATATGCACAG-3′（pHYR1.8，1.4，1.0等是笔者为方便叙述而命名的重组体，该重组体的构建包括二部分，第一部分是扩增HYR1基因上游的DNA片段，共6段）。
上述6种重组体的3′端引物相同，序列为：5′-GCGTCGAGTGGTTTCAACAAACTGGAATACTT 3′端。两端引物分别含8个保护碱基和限制性内切酶SalI与XhoI酶识别位点，它们分别是SalI酶:CCGTCGAC;XhoI酶:GCGTCGAG。PCR按常规方法进行（PE-9600 PCR扩增仪）。取5μl产物电泳判断是否扩增成功，将扩增成功的产物用PCR产物回收试剂盒回收，并电泳估计其浓度。取1μg左右的产物用XhoI及SalI酶酶切并回收（标准酶切体系），电泳估测浓度并保存。将含PNG17的菌用液体LB摇瓶约30ml培养过夜，用质粒小抽试剂盒抽提质粒并电泳检测浓度与质粒大小。取1μg左右的质粒用上述两酶酶切，碱性磷酸酶脱磷并胶回收，电泳估测浓度并保存。取合适量的已酶切的各目标片断与酶切的质粒载体用T4连接酶连接，4℃过夜。转化感受态大肠杆菌DH5α,涂板培养过夜。挑取转化子划线分离，并菌落PCR鉴定是否含有插入片断。将鉴定阳性的菌落小摇培养（3ml LB），抽提质粒，送测序。阳性克隆保种。
1.5 酵母菌EGY48的转化 将EGY48接种于YEPD液体培养基中（5ml），培养过夜（16~18h），菌液离心（14k,30s）,弃上清液，用1ml双蒸水洗涤1次，离心弃上清液。用1ml LiAC/TE洗涤1次，吸干剩余液体，振松菌体，加入50μl LiAC/TE,5μl鲑精DNA,1~2μl转化质粒，混匀，振动至无菌块，加入300μl LiAC/TE/PEG，振匀，置于30℃30min，再转置于42℃热激30min，再放回30℃5min，离心12k,1min，弃上清，加入100μl双蒸水，用枪吹打混匀，吸50μl于平板（SC-u/SGR-u）上涂布，30℃培养2~3天（48h以上）。
1.6 β-半乳糖苷酶（LacZ）活性的定性测定 在SC-u/SGR-u培养基（pH 7.0）中加入β-半乳糖苷（Xgal）1mg/ml和1%的脯氨酸，常规浇取petri培养皿。将SC-u/SGR-u平板上生长的酵母菌菌落接种其上，这些菌落为不同的酵母转化子，分别含有以上构建的6个重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2，设阳性对照，37℃培养48~72h后直接观察克隆是否能分解Xgal（变蓝色）。
2 结果
2.1 重组体的鉴定 以白念珠菌ATCC10261染色体DNA为模板，PCR扩增得到6个具有3′端的长短分别为200bp、400bp、600bp、1000bp、1400bp、1800bp的片段分别作为启动子，与不含启动子的载体PNG17组成重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2，这些重组体（图3）插入的片段相应于HYR1基因上游-1800~+43bp、-1400~+43bp、-1000~+43bp、-600~+43bp、-400~+43bp、-200~+43bp,经测序，插入片段与报道［1］的序列完全一致（测序结果未现）。
2.2 酵母转化子的建立 将6种重组体转化啤酒酵母EGY48，在SC-u/SGR-u培养基上30℃培养2~3天，可见酵母菌菌落生长，表明转化成功（图4），这些转化子分别含有重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR0.6、pHYR0.4、pHYR0.2。
2.3 在脯氨酸作用下各转化子β-半乳糖苷酶（LacZ）的活性 在含Xgal的SC-u/SGR-u培养基上，含有不同重组体的各转化子生长良好，其中在脯氨酸作用下，培养2天后pHYR0.4、pHYR0.6、pHYR1.0、pHYR1.4、pHYR1.8均呈蓝色，只有pHYR0.2不显色（图5），表明含pHYR0.4的转化子具有β-半乳糖苷酶的活性，它能分解培养基中的Xgal而使菌落呈蓝色。
图3 重组体电泳分析结果 （略）
图4 在选择培养基SCu/SGRu上生长良好，说明重组体构建成功 （略）
图5 相应的转化子呈蓝色（略）
3 讨论
从酵母相向菌丝相的转换是白念珠菌最主要的毒性因子。这种菌相转换受多种因素的影响［2~4］，多个基因参与并特异性地调节这一过程［5，6］。HYR1基因已被证明是白念珠菌菌相转换的特异调节基因［1，7］，它的上游也存在一些调控元件控制其表达。脯氨酸是菌相转换的重要因素，但它如何激活转录这些基因目前尚不清楚。笔者根据不同的集中的区域，分段克隆了不等长的片段［8］，构建到带LacZ报告基因的载体PNG17上。LacZ基因所编码的β-半乳糖苷酶可催化无色的底物Xgal变成蓝色，通过观察含有Xgal的培养基是否会变蓝色可以判断是否有LacZ基因表达。
实验中，含有重组体pHYR0.4、pHYR0.6、pHYR1.0成、pHYR1.4、pHYR1.8的转化子在脯氨酸诱导下分解培养基中的Xgal而使菌落成为蓝色，只有pHYR0.2不显色，即在HYR1基因上游-400~-200bp基因之间存在转录启动活性，含有与脯氨酸相关的调控元件。脯氨酸通过特殊的信号传导通路，激活该调控区的启动子，使得HYR1基因表达，从而参与了白念珠菌菌相转换的调节。
质粒PNG17是一个可以在大肠杆菌以及酿酒酵母菌中穿梭表达的穿梭质粒。既含有大肠杆菌的复制起点pMB1 ori，也含有酵母菌复制起点ARS。同时带有大肠杆菌中表达的氨苄青霉素抗性基因以及酵母菌的尿嘧啶合成酶的基因ura3作为筛选标记。作为一个酵母菌中检测启动子的报告载体，它带有LacZ基因，同时在该基因上游带有多克隆位点供插入片断。该载体可以方便地通过大肠杆菌进行克隆并扩增，然后转化酿酒酵母进行启动子研究［9］。
由于白念珠菌并非使用CUG密码子，常规报告基因系统不适用于白念珠菌［7］，且白念珠菌目前研究相对较少，缺陷型菌株比较难以获得，这阻碍了白念珠菌基因上游启动活性的研究。酿酒酵母与白念珠菌进化上非常相近，同时它已经是一个研究十分成熟的模式生物，借用它的已有的研究系统来对白念珠菌进行探索具有一定的合理性。所以笔者采用pNG17来对白念珠菌的基因启动区域进行分析。实验中，转化子在SC-u/SGR-u培养基上生长良好，带有相关启动子序列的重组体能分解培养基中的Xgal，使菌落呈蓝色，表明该报告基因系统稳定可靠，重复性好。该系统的建立克服了在白念珠菌研究中缺乏合适报告基因的问题，为进一步研究白念珠菌基因的调控奠定了基础。
实验中发现采用酿酒酵母的报告系统对白念珠菌进行分析是有一定的限制的。如酿酒酵母的最适生长温度是30℃，而白念菌则最好能在37℃进行培养以模拟正常生长环境，这就在一定程度上影响了调控因子与分析片断的结合。而虽然酿酒酵母与白念珠菌在进化上相对较近，但它们之间仍有差异，比如一些基因是否在两种菌中都有直系同源物还处于研究探讨阶段，这也会对最终的分析结果产生影响。这些就要求采用pNG17来研究时需要分析所研究的基因是否在两种酵母中都存在［10］，同时尽量选择一些合理的分析条件。不过最好是能得到白念珠菌的缺陷株，然后改造载体使其适用于白念珠菌。实验中，阳性对照则选择了酿酒酵母DNA结合蛋白GAL4特异结合转录的特定DNA区段（UAS，克隆自酵母菌株Y190），该片段可以与酵母菌中的GAL4转录因子特异结合，并受其调控转录下游基因。
【参考文献】
1 Bailey DA, Feldmann PJF, Bovey M，et al. The Candida albicans HYR1 gene, which is activated in response to hyphal development, belongs to a gene family encoding yeast cell wall proteins. J Bacteriol,1996,178（3）:5353-5360.
2 Chaffin WL, Lopez-Ribot JL, Casanova M, et al. Cell wall and secreted proteins of Candida albicans: identification of infection and expression. Microbil Mol Biol Rev,1998,62（3）:130-180.
3 Domer JE. Intragastric colonization of infant mice with Candida albicans induces systemic immunity demonstrable upon challenge as adults. J Infect Dis,1988,157（7）:950-958.
4 Kwon-chung KJ, Riggsby WS, Uphoff RA, et al. Genetic differences between type Ⅰ and type Ⅱ Candida stellatoidea Infect. Immun,1989,57（1）:527-532.
5 Birse CE, Irwin MY, Fonzi WA, et al. Clining and characterization of ECE, a gene expressed in association with cell elongation of the dimorphic pathogen, Candida albicans. Infect Immun,1993,61（1）:3648-3655.
6 Kelly R, Miller SM, Kurtz MB. One-step gene disruption by co-transformation to isolate double auxotrophs in Candida albicans. Mol Gen Genet,1988,214（2）:24-31.
7 Staab JF, Bahn YS, Sundstrom P. Integrative, multifunctional plasmids for hypha-specific or constitutive expression of green fluorescent protein in Candida albicans. Microbiology, 2003, 149（5）:2977-2986.
8 Leng P, Lee PR, Wu H,et al. Efg1, a morphogenetic regulator in candida albicans, is a Sequence-Specific DNA binding protein. J Bacteriol,2001,183（13）:4090-4093.
9 Ernst JF.Transcription factors in Candida albicans-environmental control of morphogenesis. Microbiology,2000,146（5）:1763-1774.
10 Harbarth S, Rued C, Francioli P, et al. Nosocomial infections in Swiss university hospitala: a multi-cente surver and review of the published experience. Schweiz Med,Wochenschr,1999,23（2）:1521-1528.
（编辑：丁剑辉）
作者单位： 200003 上海，第二军医大学长征医院皮肤科