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【摘要】 目的 采用犬骨桡骨节段性缺损模型，观察骨优导（rhBMP-2加载体）对节段性骨缺损的修复作用。方法 于30只杂种狗左侧桡骨中段造成2cm缺损，将模型随机分为空白对照组（K组，6只）、载体组（Y组，6只）、骨优导低、中、高三个剂量治疗组（分别为S1组、S2组和S3组），通过放射学和组织学等手段检查。结果 骨优导作为一种含rhBMP的载体植入物，对于犬桡骨缺损模型，X线片以及X线片评分显示植入1M后，即可见骨痂长入缺损，钙盐沉积，X线片示透光区减少;植入3M，缺损桥接，骨折愈合;通过骨矿无机盐测定，骨优导三个剂量组有促进骨矿盐沉积的作用;犬骨痂组织学评分显示骨优导有促进骨痂形成和骨折愈合的作用。结论 骨优导是修复骨缺损的一种较理想材料。
关键词 骨形态发生蛋白 骨缺损
Study on segmental bone defect repaired with bone morphogenetic protein and polymer scaffold
Feng Wei，Zhou Qi，Qian Niandong，et al.
Shanghai Munieipal Institute of Bone Injury，shanghai200025.
【Abstract】 Objective To examine the effect of GuYouDao（rhBMP-2and scaffold）on the healing of bone deˉfect of adult dogs.Methods Twenty-millimeter-long bone defects were created in thirty dogs on the left middle radial shaft.The animals were randomly assigned to one of five groups（six dogs each one）and treatedwith different implantaˉtion:K nothing as control;Y scaffold alone;S1high doseGuYu;S2middle dose GuYu;S3low dose GuYouDao.All aniˉmals were then evaluated with histological and radiological methods at1，4，8，12weeks after operation andsacrificed at12weeks.Results Callus formation was observed at4weeks and radiographic union was established at12weeks in GuYuˉDao-treated groups.GuYuDao stimulated the deposition of mineral and the formation of calls according to callus histoˉlogical analysis.Conclusion GuYuDao can be used effectively to repair bonedefects.Key words bone morphogenetic protein bone defect
研制具有长期满意的生物学效应或具备天然骨生理性质的人工骨来修复骨缺损，是医学和生物材料学领域的一个重要课题。骨形态蛋白（BMP）是骨基质中一种小分子量酸性多肽类物质，具有无排斥反应和较强的诱导成骨能力，有希望成为修复骨缺损的理想材料。然而，BMP是一种量微高效的粉末状物质，既不能均匀地分布于骨缺损处，又无支撑作用。所以，BMP必须借助一种组织相容性好的载体，将BMP吸附于其中，然后将这种复合物植入体内，此载体在起到短暂地支撑作用的同时，随着BMP释放，新骨的长入，载体将溶解吸收，最后完全被新骨替代。骨优导是杭州华东基因技术研究所研制的一种含rhBMP的人工植入物，为了进一步探讨骨优导在修复骨缺损中的作用，我们观察骨优导修复犬桡骨阶段性骨缺损过程，为骨优导的临床应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 骨优导，每片载体含rhBMP0.5mg以及不含rhBMP的载体（以上均由杭州华东基因技术研究所提供）。
1.2 模型制作和分组 30只成年杂种狗，雌雄均可，体重10±2kg，分5组:模型组（K）、阴性对照组（Y）和治疗组（S），治疗组包括:低剂量组（S1）、中剂量组（S2）、高剂量组（S3），每组6只。动物采用静脉复合麻醉，气管插管后，取左侧前肢，在无菌条件下，手术去除左侧桡骨中段2cm（连骨膜），清洗骨缺损部位，擦干，治疗组分别在骨缺损部位植入4片、8片和16片骨优导，阴性对照组植入不含rhBMP载体8片，空白组不放任何制剂。依次缝合，关闭切口。术后连用3天抗生素，常规饲养。
1.3 观察指标
1.3.1 常规X线摄片观察 分别在造模后1周和造模后第1、2、3个月对每个试验动物的手术部位进行正、侧位拍X线片。对X线片的骨缺损情况按柴本甫1962标准 ［1］ 进行量化后评分。
1.3.2 无机盐含量测定 造模3个月后，取手术侧新骨愈合部分1.5cm和正常侧相应部分长约1.5cm的骨无机盐总量，105℃烤干，称取干重，然后放入灰化炉中600℃48h灰化，称取灰重，计算矿盐含量，以灰重与干重比值表示（g/g）。
1.3.3 组织学量化评分 造模3个月后，处死动物，取各组动物造模侧桡骨骨痂段，剔除软组织，95%蚁酸脱钙后，常规石蜡包埋，5μm厚连续切片，光镜观察并按组织分级法 ［2］量化评分。
1.3.4 统计学方法 采用ˉx±s对数据进行方差分析和t检验。
2 结果
2.1 犬常规X线摄片观察及量化评分 犬造模后，分别在造模后1周、1月、2月和3月四个时间点进行造模侧肢体正、侧位X线摄片（图1为模型组和低剂量组四个时间点正位片）和评分（表1）。 表1 X线片四个时间点评分 （略）注:各治疗组（Y、S）与K组比较， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01;治疗组（S）与Y组比较， ▲P<0.05， ▲▲ P<0.01从X线片上看，造模1周，各组桡骨断端整齐锐利，无骨痂，K组有4例双骨折，Y组有1例双骨折，S1和S3组各有1例双骨折。造模1个月后，治疗组（S）骨缺损区有明显骨痂形成，缺损区骨痂呈云片状，有的缺损尚未桥接，有的已部分桥接，只有小面积的透光区，骨痂密度甚至与骨密度相同;K和Y组断端模糊，只有少量骨痂，Y组有2例双骨折，S3有1例双骨折。造模2个月，K组变化不明显，Y组骨痂量变化不一，有的变化不明显，有的骨痂略有增加;而治疗组，骨痂量多，有的骨痂较膨大，呈梭形，有的塑形较好，缺损基本桥接，骨密度较深，髓腔贯通。造模3个月，与2个月比，各组变化不大。对无双骨折试验动物的X线片进行评分:在造模1周，各组间无差异。说明各组在第一时间点无促进骨痂形成的作用。在造模1个月后，K组与S1、S2、S3组间有统计学差异（P<0.05），说明骨优导具 有明显地促骨痂形成作用。在造模后2个月，骨优导三个剂量组S1、S2、S3组与K组、Y组在X线评分上均有统计学差异，P<0.05。各组在造模3个月后的骨折X线评分呈现与造模2个月后相同的水平，P<0.05，说明骨优导可加速骨修复，rhBMP具有诱导成骨的生物活性作用。见表1和图2。
2.2 犬桡骨无机盐含量测定 造模3月后，处死动物，取犬左桡骨新骨愈合部分和对侧正常部分，灰化后，以灰重/干重的比值进行比较（见表2和图3）。 表2 犬左右桡骨中矿盐含量 （略）经分析:右桡骨骨矿无机盐各组间除S2与Y组有差异外（P<0.05），其余组间无差异;左桡骨Y、S1、S2、S3组与K组有显著的差异（P<0.05）;而S1、S2、S3与Y四组间除S3与Y无差异外，S1、S2组与Y组之间有差异（P<0.05）;S1、S2、S3组间比均无统计学的差异。
2.3 犬骨组织学评分 根据组织切片计数，K组骨不连，无连续骨痂形成;与其它组比有显著差异，计数为0。其它组取骨痂中段一张切片，重点观察，发现:Y组新生骨组织，骨小梁形成，同时可见未成熟骨痂;软骨内成骨，紫色为软骨，周围暗红色为成熟骨小梁。S1组可见成熟的骨髓组织，以及新生的骨小梁。S2组可见成熟的骨髓组织，成熟骨小梁与未成熟之骨痂交界。S3组可见成熟骨小梁和未成熟骨痂，骨髓腔丰富。结果见表3和图4。表3 犬实验性骨痂组织学评分值 （略）注:S1、S2、S3组与Y组比 ▲ P<0.05， ▲▲ P<0.01;S1与S2、S3组比较， # P<0.05;S2与S3比较 △ P<0.05。 各治疗组骨痂组织学分值高于Y组间，P<0.05;S1与S2组、S3组相比，骨痂组织学评分值均低于S2和S3组，其中S1与S3比P<0.05;S2和S3组比无明显差异。
3 讨论
骨形态发生蛋白 ［3］ （BMP）是广泛存在于骨基质中的一种酸性糖蛋白，有诱导成骨的生物学作用。骨折端的坏死、吸收可以释放内源性BMP，BMP向周围弥散，形成一个由近及远逐渐降低的浓度梯度。成骨量与BMP浓度成正比，与扩散距离成反比。在一定距离内，由于BMP在骨折端之间重叠分布，浓度高于周围组织，故骨再生总在骨端之间进行。而当骨端距离足够大时（超过临界值），内源性BMP的量及其分布将难以起到诱导趋化的作用，因此外源性BMP的应用，将弥补内源性BMP的不足。但从不同动物或人骨组织中提取BMP不仅步骤繁杂，而且效率低，因此，利用基因工程技术生产重组人骨形态发生蛋白（rhBMP）是BMP广泛运用于临床的关键。Wang ［4］ 等研究认为rhBMP与骨组织提取的BMP在诱导成骨过程中发挥着类似的作用，都是诱导局部的未分化间充质细胞分化为软骨细胞并形成软骨，随着血管的侵入，在软骨区域发生软骨内成骨，随着新骨逐渐改建成熟。但是两者在诱导软骨和骨组织形成的时间上有明显差异，通常rhBMP诱导软骨和骨形成的时间要早于骨组织提取的BMP;戴氏 ［5］ 等也证实rhBMP具有良好的诱骨活性，在诱导成骨量、血管和骨髓样组织的形成量上明显多于骨组织提取的BMP。骨优导是杭州华东基因技术研究所制备的一种含rhBMP的载体植入物，其rhBMP是利用基因工程技术在大肠杆菌中表达和纯化的产物。本实验观察 其对于犬桡骨缺损的治疗作用，结果:X线片以及X线片评分显示植入1M后，即可见骨痂长入缺损，钙盐沉积，X线片示透光区减少;植入3M，缺损桥接，骨折愈合;通过骨矿无机盐测定，骨优导三个剂量组有促进骨矿盐沉积的作用;犬骨痂组织学评分显示骨优导有促进骨痂形成和骨折愈合的作用。
本次犬骨缺损模型中，造模侧尺桡骨双骨折比较多，特别是模型组（K）高达66.67%，阴性对照组（Y）为50%，而各治疗组（S）则分别为33.33%（S1）、0（S2）和33.33%（S3）。其原因可能为:（1）动物为笼内放养，追打抢食，缺乏有效的外固定极易造成骨折;（2）骨缺损端缺乏有效地支撑，特别是模型组（K），而阴性对照组（Y）组虽然有载体支撑，但缺乏外源性BMP的有效诱导，不能及时成骨;（3）即使rhBMP能及时诱导成骨，但新骨在早期不牢固，没有进行良好塑形改造，也容易造成双骨折，今后此类节段性骨缺损模型造模后一定要有良好的外固定，可避免双骨折。（本文附图见封三）
参考文献
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作者单位:200025上海市伤骨科研究所
（收稿日期:2004-06-29）
（编辑黄杰）