半胱氨酸蛋白酶与消化系肿瘤化疗

　　［摘要］  半胱氨酸蛋白酶（Caspases）激活级联反应在凋亡调控中占核心作用，它涉及2条主要途径：死亡介导途径和线粒体依赖途径。不同的凋亡刺激信号经各自特定途径的起始不同的Caspases级联反应，进而激活下游的效应Caspases，诱发细胞凋亡。研究发现有些细胞毒化疗药物通过半胱氨酸蛋白酶而诱导消化系肿瘤细胞凋亡。目前，通过调节Caspases的活性促使癌细胞凋亡是肿瘤治疗研究中一个值得探索的领域。

    ［关键词］  半胱氨酸蛋白酶；细胞凋亡；消化系肿瘤；化疗

    近年来，随着研究的深入，在哺乳动物体内发现了多种半胱氨酶蛋白酶。这些结构特点相似的酶构成了一个蛋白酶家族，称之为Caspases家族。它是执行细胞凋亡的主要酶类。这些蛋白酶在细胞凋亡中的作用及机制和在肿瘤的发生、发展及化疗中的意义，是肿瘤学基础及临床研究领域的热点之一。本文就Caspases与细胞凋亡、凋亡调控基因、消化系肿瘤及化疗的关系作一简要综述如下。

    1  Caspases家族概述

    1993年Yuan等发现秀丽隐杆线虫的Ced-3基因与哺乳动物细胞ICE（interleakin-1β converting enzyme）存在功能和序列上的高度同源，与ced-3一样ICE高表达可导致啮齿动物成纤维细胞凋亡。目前在哺乳动物细胞中已发现有14种ICE/ced-3蛋白酶家族成员［1］，命名为半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific protease），简称Caspases，有学者称之为“半胱天冬酶”。它们具有相似的氨基酸序列、结构和底物特异性。许多Caspases在哺乳动物的细胞凋亡中发挥重要的作用。细胞凋亡是从内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号，传递至Caspases，并使其活化为开始，以蛋白底物裂解、细胞解体为结局，从而使细胞凋亡得以完成。因此，对于Caspases的深入研究将对其依赖的细胞凋亡相关肿瘤和疾病有可能提供治疗的又一新靶点，从而为基因治疗提供新的途径。

    1.1  Caspases的生物学特性  Caspases最初表达为蛋白酶的形式，基本结构包括：N端结构域——参与酶功能激活调节及大、小亚基——提供与底物结构及催化所需的氨基酸。Caspases可专一、高效地特异性水解一系列的蛋白底物，并导致蛋白质功能

    丧失或改变［2］。Caspases按功能分为启动子Caspases即Caspases-2、Caspases-8、Caspases-9、Caspases-10和效应子Caspases，即Caspases-3、Caspases-6、Caspases-7。效应子被启动激活，执行最终的凋亡效应，Caspases-3（CPP32）是最重要的细胞凋亡执行者之一［3］。而启动子Caspases则被特定的结合蛋白、其他Caspases及本身激活［4］。这些结合蛋白质将凋亡信号和Caspases联系起来，决定2种基本凋亡途径：线粒体途径和死亡受体途径。最近报道的第3条途径是小鼠体内的Caspases-12介导内质因特异性凋亡［5］。

    1.2  Caspases与调控基因

    1.2.1  p53基因  p53基因作为一种转录因子能促进或抑制很多与细胞周期及凋亡相关基因的表达（如p21和Bax等）。因此，p53可通过直接或间接调节凋亡通路中多个关键因子而调控凋亡。Burns［6］的研究发现人肿瘤细胞过表达p53能诱导该细胞凋亡，而特异性抑制剂分别抑制了Caspases-8及Caspases-9后均能抑制这种p53依赖的凋亡。Fuchs等发现放射损伤引起的小鼠胸腺细胞凋亡时，p53依赖于Caspases-3的活化。但p53亦能抑制昆虫、线虫、哺乳动物细胞的凋亡，p53阻断细胞凋亡机制在于与Caspases家族成员（包括Caspases-1、Caspases-2、Caspases-3、Caspases-4）形成p53-Caspases复合体，从而抑制Caspases催化活性。

    1.2.2  Bcl-2家族  Bcl-2家族迄今为止发现的Bcl-2家族同源蛋白不少于15种，均含有1种以上Bcl-2家族共同源序列（BH1-BH4）。按结构功能不同分为前凋亡蛋白（preapoptotic protein）和抗凋亡蛋白（antiapoptotic protein）。Bcl-2或其他抗凋亡蛋白过表达使许多本可致PT孔（permeability transition pore,PTP）开放，细胞色素C及凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）释放的刺激失效，Caspases活化降低，从而抑制凋亡；而前凋亡蛋白（又称凋亡蛋白）Bax过表达导致线粒体跨膜电位缺失及细胞色素C释放，导致Caspases活化增强，促进凋亡。另外，Bcl-2C末端产物能触发细胞凋亡，裂解产物进一步激活下游的Caspases，并导致Caspases级联反应放大。

    1.2.3  Cmyc基因  Cmyc基因是调控细胞增殖的重要基因，其表达产物Cmyc蛋白是一种转录因子。在Cmyc介导的细胞凋亡过程中，可见Caspases-3进入活化状态，当其选择性抑制时，能部分抑制Cmyc诱导的细胞凋亡，说明Caspases蛋白酶家族，尤其是Caspases-3参与了Cmyc介导的细胞凋亡途径［7］。

    此外，还有一系列蛋白称为凋亡抑制因子（inhibitors of apoptosis,IAP），具有直接阻止凋亡作用，IAP与Caspases蛋白酶结合可使后者失活。虽然其抑制目标还不清楚，但在体外实验中可抑制Caspases-3和Caspases-7；CrmA亦能抑制某些启动性Caspases，抑制细胞凋亡发生；TGFβ能阻止神经鞘氨醇诱导的HL-60细胞中Caspases-3活化，抑制细胞凋亡。以上说明各不同调控基因与Caspases关系密切，且影响Caspases蛋白酶的活化，进而促进或抑制细胞凋亡。

    2  Caspases与细胞凋亡

    1972年Kerr等［8］根据细胞形态学特点，首次提出细胞凋亡（apoptosis）这一概念。细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PDC），是一种基因控制的细胞自主性死亡过程。它是多细胞生物体内的一个重要生命征象，既出现在个体发育过程中，也出现在正常生理状态或疾病中；既在体内发生，也出现在体外培养物中。细胞凋亡的形态学和生物化学改变。

    2.1  形态学改变  细胞凋亡涉及单个细胞成为非同步发生的一小部分细胞。先为单个细胞与周围细胞分离，细胞皱缩、胞质凝缩、细胞器聚集、核染色逐渐浓集。以后胞核固缩、碎裂，细胞下陷包裹碎片和细胞器，形成包膜完整的凋亡小体（apoptotic bodies）。凋亡小体很快被邻近的细胞吞噬降解。

    2.2  生物化学改变  （1）钙离子和蛋白激酶改变：细胞内Ca2+的堆积和重新分布，细胞核内Ca2+增多，激活核酸内切酶的活性；（2）核酸内切酶激活把DNA降低成180～200碱基对倍数的核苷酸片段，呈梯状电泳现象；（3）组织谷氨酰胺转移酶的积累并激活；（4）细胞骨架如肌动蛋白的变化；（5）细胞表面糖链、植物血凝素与玻连蛋白的受体增加，磷酯酰氨酸的外露可改变细胞表面的生化特性。随着对细胞凋亡的研究深入，目前学者们认为Caspases是细胞凋亡机制中重要的效应因子之一，现已发现14种Caspases家族成员，其中至少2/3的Caspases与细胞凋亡相关并参与多种与凋亡有关的机体生理性或病理性过程。

    3  Caspases与消化系肿瘤

    以往对肿瘤的研究，多认为肿瘤细胞无限增殖是肿瘤形成的关键。近年来，随着对细胞凋亡研究的深入，人们越来越重视细胞凋亡与肿瘤的关键，认识到组织的内环境稳定实际上是细胞增殖和死亡之间的平衡。现认为在肿瘤发生、发展的各个阶段均存在细胞凋亡，与Caspases家族有着密切关系。消化系肿瘤亦是如此。Hoshi等［9］研究33例人胃癌组织发现，Caspases-3的表达较正常组织明显降低，提示Caspases介导细胞凋亡的异常降低可能与胃癌的发生密切相关；国内林万隆等［10］对50例胃癌组织中Caspases-3和bclx2表达的研究结果与Hoshi报道一致。在肝癌的研究中，Medema等认为Caspases-3、Caspases-8参与了Fas介导的肝细胞癌凋亡；Hasegawa等研究发现Caspases-3抑制剂DEVDCHO能抑制Caspases-3活化从而抑制Fas介导的肝癌细胞凋亡。近年来，孙海晨等［11］对胰腺癌的研究发现Caspases-1和Caspases-2在胰腺癌细胞ASPC-1凋亡过程中起重要作用；而张为强等［12］在大肠癌的研究中发现，CPP32（Caspases-3）表达与降低大肠癌的形成有密切关系；Turnuen等在胆癌的研究中发现，胆囊癌中有Caspases-3、Caspases-6和Caspases-8的高表达，且这些蛋白酶的表达水平随肿瘤组织凋亡细胞的增多而增高，提示Caspases在胆囊癌的形成发展中起重要作用；而国内何忠野等［13］研究表明Caspases-3表达下调与胆囊癌的发生、发展有关。总之，Caspases在消化系肿瘤的形成发展中有着重要的作用，深入研究Caspases的调控及Caspases与细胞凋亡、消化系肿瘤的形成发展的关系，有利于肿瘤的治疗。

    4  Caspases与消化系肿瘤化疗

    自1993年Kaufmamn等发现足叶乙甙（VP-16）可诱导HL-60细胞出现聚ADP核苷多聚酶（PolyADPRiobsePolyMerase,PARP）裂解，导致DNA断裂后，大量研究表明，许多抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的作用是通过启动细胞凋亡机制完成的。细胞凋亡是许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长的主要机制之一，能否诱导肿瘤细胞凋亡已成为重要指标之一。而化疗诱导肿瘤细胞凋亡大多需要有Caspases参与，反义的Caspases-1和Caspases-3强烈抑制药物诱导的凋亡。在化疗诱导肿瘤细胞凋亡信号传导通路的研究过程中发现，线粒体依赖的Apaf-1/Caspases-9和非线粒体依赖的FADD/Caspases-8 2条通路中，生长因子去除和细胞内应激（化疗和放疗）往往激活Apaf-1/Caspases-9通路，但2条通路也存在着重叠交叉。近年来，许多学者对消化系肿瘤的化疗与Caspases的关系做了深入研究。Suzuki等研究认为，Caspases-3在多种凋亡诱导剂诱导肝癌细胞凋亡过程中活性增高；吕军［14］等研究表明，与氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中Caspases-3活性明显增高，提示Caspases-3参与了5-氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡；Micheau等在大肠癌化疗的研究中发现，喜树碱、5-氟尿嘧啶能通过Fas系统介导激活Caspases级联反应，导致结肠癌细胞凋亡；而Fuda等亦发现在大肠癌等化疗敏感的肿瘤中，CASP表达明显高于肾癌等对化疗不敏感的肿瘤，提示CASP在大肠肿瘤化疗敏感性中起一定作用；Hinz等［15］在胰腺癌诱导化疗中发现，体外胰腺癌细胞被转染过表达的Caspases-3后并不能导致其凋亡发生，但给予小剂量5-氟尿嘧啶，即可引起Caspases-3活化，大量胰腺癌细胞发生凋亡，提示5-氟尿嘧啶可激活Caspases-3引起胰腺癌细胞凋亡发生。总之，Caspases与消化系肿瘤化疗关系密切，能否激活Caspases酶系级联反应，导致肿瘤细胞凋亡，亦是检验消化系肿瘤化疗药物疗效的一个标准。

    5  小结

    尽管Caspases家族与消化系肿瘤化疗的研究已取得了很大进展，了解了Caspases是化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡调控通路的关键。但仍许多问题尚待解决：目前缺乏体内评价Caspases的有效疗法；还不清楚体外诱导激活Caspases酶级联反应与临床治疗效果是否一致；临床如何利用诱导药物合理配伍最大程度地降低正常组织的Caspases级联反应激活，而减少凋亡对正常组织的损伤是值得进一步研究的课题。相信随着对Caspases与消化系肿瘤的研究深入，必将为消化系肿瘤发病机制的简述提供更多的理论依据，同时为消化系肿瘤治疗开辟新的思路和方法。

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    作者单位： 1 412000 湖南株洲，株洲市一医院肝胆外科

    2 410083 湖南长沙，中南大学湘雅医院普外科

　　 (编辑：杨  熠)