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【摘要】 目的 观察三勒浆抗疲劳液对慢性疲劳大鼠模型的多因素影响作用，为深入探讨其药理学作用的机制奠定基础。方法 采用长时间反复强迫大鼠游泳及束缚四肢（限制大鼠的活动）法，造成慢性疲劳的大鼠模型，悬尾法及力竭游泳法考查模型动物行为学指标，并采用ELISA法测定其细胞因子IL-1b、IL-6及神经递质5-HT。结果 空白对照组动物一般情况、行为学观察及IL-1b、IL-6、5-HT等多项指标与模型组比较差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01），证明模型成立。而三勒浆抗疲劳液具有改善造模大鼠一般情况及行为学指标的作用。同时上调血清中IL-1b及脑组织中5-HT，与模型对照组比较，差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。结论 用强迫大鼠游泳（30min/d）及束缚四肢法（3h/d）造模，所形成的慢性疲劳大鼠模型更趋向于因心理应激所形成的机体症状性疲劳模型，三勒浆抗疲劳液对此种慢性疲劳大鼠模型的一般情况、行为学指标均有明显的改善作用，对IL-1b、5-HT的上调，可能为其药理学作用机理。
【关键词】 三勒浆抗疲劳液；慢性疲劳；大鼠模型；实验研究
Using chronic fatigue rat model to investigate the pharmacologic mechanism of Sanajon oral liquid
WANG Zheng-yi，JIN Yu-fang，CHEN Jin-bi,et al.Sanajon Pharmaceutical Group, Sichuan Research Institute of Natural Drugs,Chengdu 610041, China
【Abstract】 Objective To observe the effect of chronic fatigue rat model which influenced by Sanajon oral liquid, to study the pharmacology mechanism. Methods Adopt force rat swim and bondage on four limbs repeatedly , to cause rat chronic fatigue ; By hanging rat tail and swimming exhaust physical strength approach, to observe rat ethology changes; Utilizing ELISA method, examination cytokine IL-1b, IL-6 and 5-HT.Results Comparing control group with chronic fatigue model group, there have significance difference about rat general condition, ethology changes, IL-1b, IL-6 in serum and 5-HT in brain(P＜0.05 or P＜0.01). At the same time, all of above examination item can be improve by Sanajon oral liquid(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion This kind of chronic fatigue rat model have more psychological stress which induce to psychological fatigue, Sanajon oral liquid can improve model rat’s general condition, ethology changes, IL-1b, IL-6 in serum and 5-HT in brain.
【Key words】 anti-fatigue Sanajon oral liquid;chronic fatigue;rat model;experiment study
三勒浆抗疲劳液为国内抗疲劳产品中的知名品牌，在长期的临床运用中，显示出较好的疗效，为进一步探讨该产品抗慢性疲劳的作用机理，我们进行了动物实验的初步研究。
1 实验材料
1.1 动物 SD大鼠，体重160～180g，雌雄各半，共50只，合格证号：SCXK（川）2004-11，供应单位：成都中医药大学实验动物供应中心。
1.2 供试品 三勒浆抗疲劳液，0.5g生药/ml，30ml/支，红棕色液体，批号：Y20040702，人临床用量及给药途径：30ml/次，1天1次，口服。供应单位：成都三勒浆药业集团四川华美制药有限公司。
1.3 主要实验仪器及试剂
1.3.1 大鼠游泳池 长80cm，宽80cm，高80cm。
1.3.2 板式酶标仪 型号：ZS-2，北京市新风机电技术公司。
1.3.3 台式高速冷冻离心机 型号：TGL—16G,上海安亭科学仪器厂。
1.3.4 大鼠IL-1b ELISA检测试剂盒 批号：TCV5102-BS62031，规格：96T，BPB Biomedicals,Inc.大连泛邦公司提供。
1.3.5 大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒 批号：TCV5102-BS62031，规格：96T，BPB Biomedicals,Inc.大连泛邦公司提供。
1.3.6 大鼠5-HT ELISA检测试剂盒 批号：TCV5102-BS62031，规格：96T，BPB Biomedicals,Inc.大连泛邦公司提供。
2 实验方法
2.1 动物分组 经检疫合格后，将50只大鼠计算机完全随机分成5组，每组10只，分别为低、中、高三勒浆抗疲劳液组、模型对照组及空白对照组。分笼饲养，每笼动物5只。正式试验前，各组动物适应性饲养7天。
2.2 剂量设置及给药 按体表面积折算，大鼠用量为1.5g生药/kg；以此为低剂量，各组设置如下：低剂量组：1.5g生药/kg；中剂量组：3g生药/kg；高剂量组：6g生药/kg,空白对照组及模型对照组灌服等体积纯水。
2.3 慢性疲劳动物模型的建立 大鼠从第8天起，除空白对照组外，其他各组动物开始接受23天不同的应激性刺激，即单日冷水［(21±1)℃，水深50cm］游泳，每次30min；双日束缚应激［1］，用胶布束缚鼠四肢，每次3h，每天1次。造模同时，给药组动物灌胃对应剂量的供试品连续23天，每天1次，空白对照组灌胃相同体积的生理盐水。
2.4 观察指标
2.4.1 一般情况观察 造模期间，每天观察并记录鼠的饮水量、进食量、体重及鼠毛色泽等一般情况。
2.4.2 动物行为学观察
2.4.2.1 鼠尾悬挂实验 测定情绪反应及体力情况。距大鼠尾端1cm的部分穿过中央钻有直径1cm孔的有机玻璃板，板离地面1 m左右，使大鼠呈倒挂状。悬挂两侧用板隔开动物视线，大鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”，显示“失望”状态。观察6min内的挣扎次数(大鼠由倒挂向上翻转的总次数)及不动时间(大鼠处于完全静止不动状态的总时间)。
2.4.2.2 力竭游泳实验 测定情绪反应及体力情况。游泳时水深为50cm、水温(28±1)℃。游泳前16h大鼠禁食不禁饮。灌胃给药30min后，将标记好的大鼠同时置入游泳池，记录大鼠从入水到游泳至力竭(头部沉入水中10秒中不能浮出水面为力竭标准)的时间。
2.4.3 对细胞因子白细胞介素-1b(IL-1b)、白细胞介素-6(IL-6)及神经递质五羟色胺（5-HT）的影响
2.4.3.1 血清标本的采集 采用腹主动脉采血法，收集大鼠血液4ml，静置2h，3000rpm离心，分离血清，取上清液为待检测样品。按照试剂盒要求检测样品IL-1b、IL-6和5-HT含量，于酶标仪450nm处测OD值，绘制标准曲线，并查出各样品中相应的含量。
2.4.3.2 对血浆、脑组织中5-HT活性的影响 检测标本的采集：各组动物取血后，断头处死，迅速取出下丘脑和垂体组织，电子天平称重后，以1：30（W/V）的比例加入BPS，立即贮存于-20℃冰箱保存，待测。检测时，将脑组织在冰浴条件下匀浆，低温离心机3500rpm离心10min，取上清液进行检测。
按照5-HT试剂盒要求检测，于酶标仪450nm处测OD值，绘制标准曲线，并查出各样品中相应的含量。
2.5 统计学方法 以统计软件SPSS11.0单因素方差分析进行统计学处理。
3 实验结果
3.1 一般情况研究结果 结果见表1～3。笼旁观察，模型组大鼠较其他组动物的活动量明显下降，对外界刺激反应不敏感，迟钝。从大鼠一般情况的数据分析来看，慢性疲劳造模组大鼠在饮水量、饮食量及体重等多方面均有较明显的下降的趋势，其中饮食及体重方面与空白对照组比较差异有显著性；三勒浆抗疲劳液给药组大鼠与模型对照组比较，总体情况有改善的趋势，其中饮水量与模型对照组比较差异有显著性，其他两项指标均值亦明显高于模型对照组，但与模型对照组及空白对照组比较差异无显著性，说明三勒浆抗疲劳液在改善慢性疲劳动物模型的一般情况方面具有一定的作用。
3.2 一般行为学研究
3.2.1 大鼠尾部悬挂试验 结果见表4。从数据分析可以看出慢性疲劳模型组大鼠挣扎次数与空白对照组比较差异有非常显著性（P＜0.01）；与低剂量给药组比较差异有显著性（P＜0.05）；各组与空白对照组比较均差异有非常显著性；从大鼠不动时间的分析数据中可以看出模型大鼠不动时间均值长于其他各组动物，与三勒浆中剂量组比较差异有显著性（P＜0.05），但与空白对照组比较差异无显著性。
3.2.2 大鼠力竭游泳试验 结果见表5。从试验结果分析，未经游泳造模训练的空白组大鼠力竭游泳时间明显短于其他各组（P＜0.01）。给药组大鼠力竭游泳时间均明显长于模型对照组，说明三勒浆抗疲劳液具有对抗慢性疲劳的作用。表1 大鼠各组饮水量变化结果注：Δ造模结束前1天死亡3只大鼠。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，**P＜0.01表2 大鼠各组饮食量变化结果注：Δ造模结束前1天死亡3只大鼠。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05表3 大鼠各组体重变化结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，**P＜0.01表4 大鼠尾部悬挂试验结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，**P＜0.01；与空白对照组比较，▲▲P＜0.01表5 大鼠力竭游泳试验结果注：Δ试验测试前死亡2只大鼠。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。中、高剂量组大鼠力竭游泳时间超过5400s(90min)后，未继续记录观察，故均值以大于表示。与模型对照组比较，*P＜0.05；表示与模型对照组比较，**P＜0.01；表示与空白对照组比较，△△P＜0.01
3.3 大鼠血清IL-1b检测 试验结果见表6。空白对照组及中剂量给药组与模型对照组比较差异有非常显著性（P＜0.01）；高剂量组与模型对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。表6 大鼠血清IL-1b检测结果 注：Δ有1份样品出现溶血。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，**P＜0.01
3.4 大鼠血清IL-6检测 结果见表7。经统计学分析，空白对照组与模型组比较差异有非常显著性（P＜0.01）。各剂量给药组大鼠血清中IL-6含量有上调的趋势，但与模型对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。表7 大鼠血清IL-6检测结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，**P＜0.01
3.5 大鼠血清5-HT检测 结果见表8。经统计学分析，各组间比较无统计学意义（P＞0.05）。表8 大鼠血清5-HT检测结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析；各组间差异无显著性
3.6 大鼠下丘脑、垂体5-HT检测 结果见表9。空白对照组、低剂量组及中剂量组与模型组比较，差异有非常显著性（P＜0.01）；高剂量组与模型组比较差异有显著性（P＜0.05）。模型对照组大鼠下丘脑及垂体中5-HT含量明显低于其他各组动物。表9 大鼠垂体、下丘脑中5-HT检测结果 注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01
4 讨论
中医学认为慢性疲劳是一种涉及多脏腑、多系统功能失调的疾病，与气机失调关系密切，其发病多与情志不遂、劳逸、外邪有关［2］。而西医学认为应激是导致或诱发慢性疲劳的重要因素。其中又以长期的慢性应激较急性应激更为多见。本试验造模原理符合中、西医学对慢性疲劳的认识。本次实验，采用大鼠慢性应激（反复应激性刺激维持3周）的方法［1］，拟制造慢性疲劳大鼠模型。通过对大鼠一般情况的观察，造模组与空白对照组之间存在明显的差异：模型动物活动量、饮水量、饮食量及体重明显低于空白对照组，说明慢性应激已影响大鼠的生理机能，符合慢性疲劳大鼠机体整体的变化规律，为慢性疲劳大鼠模型的形成奠定了客观的基础。而大鼠因体重、饮食量的下降也是间接导致动物的体力及抗疲劳能力下降的重要因素之一。三勒浆抗疲劳液给药组大鼠对以上各指标与模型对照组大鼠比较均有一定的改善趋势，提示三勒浆抗疲劳液能改善造模大鼠的机体状况，对抗因慢性应激而造成的机体一般情况的下降。
动物行为学研究中，鼠尾悬挂试验，模型组大鼠表现出明显的疲劳及抑郁状态，其挣扎次数明显低于空白对照组，不动时间也有明显延长的趋势。说明造模组大鼠已处于体力及精神的疲劳状态，对存在的刺激反应程度下降，进而产生一种抑郁状态。而灌胃三勒浆抗疲劳液的造模大鼠，上述各指标均有所改善，有明显对抗慢性疲劳及抑郁状态的作用。力竭游泳试验是考察动物体力一个经典试验，但试验本身受影响的因素较多，特别是动物自身状态直接影响试验结果。本研究过程中，发现所有造模动物在最初的游泳训练中，其游泳能力均相对较弱（多数动物游泳时间不超过20～30min），但经3周时间的训练后，游泳能力显著增强，这也导致未经训练的空白组大鼠在最终的力竭游泳时间的测定过程中，明显低于其他各组，而影响了试验的判断。这种现象可能与伴随大鼠对游泳环境的逐渐熟悉，对水温、训练规律的了解，以及抑郁情绪的强化，入水后大鼠的紧张惊恐情绪及游泳动作幅度（单位时间的体力消耗量）均明显的低于空白对照组，造成与空白对照组的不可比性。但在所有造模大鼠相同的试验条件下，造模组的游泳能力仍不及三勒浆抗疲劳液组（P＜0.05），提示大鼠各剂量组灌胃三勒浆抗疲劳液后，体力均能得到较好的恢复，进一步明确了其抗疲劳的作用。
在大鼠血清IL-1b、IL-6的测定结果中，本次实验条件下，研究结果与有关试验结论有一定的差异［3］,模型对照组血清中IL-1b、IL-6含量均低于空白对照组。张有志［4］在观察柴地合方对慢性应激抑郁模型大鼠多种免疫功能影响时，取脾脏进行淋巴细胞体外培养，以放射免疫法测定淋巴细胞的IL-1b和IL-6分泌水平, 结果IL-1b和IL-6分泌水平降低。孙开宏［5］在观察中小负荷运动对心理应激大鼠血清IL-1b含量的影响时，发现慢性心理应激后，大鼠血清中IL-1b水平显著低于对照组，而经不同强度的运动训练后，IL-1b水平显著升高。说明运动训练可以降低心理应激反应程度。
本次试验采用30min/天游泳和3h/天捆绑的间隔应激性刺激方法，其中游泳主要目的是造成大鼠的体力和精神疲劳，而捆绑主要是给予心理上的应激性疲劳。从本次试验研究似乎可以看出，该种造模方法对大鼠的心理应激反应的表现更为明显，这可能与大鼠在3周的时间内逐渐适应隔天1次的游泳（体力疲劳为主）训练有关。而经灌胃三勒浆抗疲劳液后，大鼠血清IL-1b水平明显升高（中、高剂量组与模型对照组比较差异有显著性）；IL-6血清水平亦有提升趋势。由此可见，促进IL-1b和IL-6在心理应激反应环境条件下的提升，可能成为三勒浆抗疲劳液对抗症状性脑疲劳的一个重要实验研究依据。
在对血清和脑组织5-HT含量测定分析中，发现血清5-HT含量各组间无明显的差异,说明该造模条件下，对血清5-HT的影响不敏感。而对下丘脑及垂体组织匀浆上清液中5-HT含量测定发现模型组5-HT明显低于其他各组。5-HT是调节机体精神活动的一种重要神经递质，该模型5-HT的下降似乎更符合经典的抑郁症发病的5-HT能与肾上腺素（NE）能神经低下学说［6］，与心理应激所造成的机体症状性疲劳相关。而三勒浆抗疲劳液对5-HT的上调作用，似乎再次证明其对症状性脑疲劳的药理学作用。
【参考文献】
1 刘雁峰，王天芳，杨维益，等．慢性疲劳的中医病理机制探讨及实验研究一复合应激因素致慢性疲劳动物模型的研制及其行为学观察．中国中医基础医学杂志，1998，4(增刊)：157.
2 李峰，杨维益，梁嵘，等．从中医学看肝脏调节应激反应的作用．北京中医药大学学报，1998，21(1)：20-22.
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4 张有志，聂惠民，胡愉，等. 柴地合方对慢性应激抑郁模型大鼠免疫功能的影响. 中国中医基础医学杂志，2004,10(9)：43-46.
5 孙开宏，尹剑春，颜军，等. 运动训练对应激大鼠血清皮质酮和白细胞介素1β的影响. 西安体育学院学报，2004,21(6)：50-53.
6 Kakigi T，Maeda K，Kaneda H，et al.Repeate administration of antidepressant drugs reduces regional smoatostatin concentratioas in rat brain．J Affeetive Disorders，1992，25：215-210．
作者单位： 610041 四川成都，四川省天然药物研究所
编辑：李 木)