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Wang Jian，Chen Shawei
Institute of Geriatrics，Shanghai City of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200032.
【Abstract】 Objective To observe protective effect of Tiao-Xin Prescription on PC12cell oxidation injury induced by H 2 O 2 .Methods PC12cells were divided into four groups:the normal，the control，the Tiao-Xin pre-scription，and the N-acetyl-cysteine.And the research was made on these aspects including cell-survival rate，SOD activity，the contents of GSH and MDA，and the expression of iNOSmRNA.Results Tiao-Xin prescription could in-crease the cell-survival rate，SOD activity and GSH contens，reduce the MDA contents，and down-regulate the ex-pression of iNOSmRNA.Conclusion Tiao-Xin prescription could remove free radicals，inhibit lipid peroxidation a-bility and probably reduce the generation of NO，and protect the oxidation injured cells.
Key words Tiao-xin prescription PC12cells oxidation injury Alzheimer's disease
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是老年人常见的神经系统变性疾病，其病机迄今未明，近年来，有关氧化应激损伤与自由基毒性在AD发病中的重要作用已成为人们研究的焦点 ［1］ 。本文以H 2 O 2 氧化损伤PC12细胞为模型，研究临床有效的调心方是否对氧化损伤的神经元有保护作用，从而为深入研究调心方的抗氧化机制及对AD的治疗提供有意义的资料。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 PC12细胞株（购于中国科学院上海细胞生物研究所）置于37℃含5%CO 2 的孵箱中培养，培养液为RPMI-1640，内含10%灭活新生牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，pH为7.2～7.4，隔天换一次培养液。用于实验时，接种PC12细胞于24孔培养板（2.5×10 6 个/ml，0.4ml/孔）。
1.2 细胞分组及药物处理 （1）正常组:PC12细胞正常培养，不加任何处理。（2）模型组:PC12细胞用1mM H 2 O 2 （终浓度）处理。（3）调心方组:PC12细胞先加50μg/ml调心方（终浓度）孵育2h，再加1mM H 2 O 2（终浓度）。（4）乙酰半胱氨酸组:PC12细胞先加10mM乙酰半胱氨酸（终浓度）孵育2h，再加1mM H 2 O 2 （终浓度）。以上各组继续孵育24h。
1.3 细胞存活率测定（MTT assay） ［2］ MTT［3-（4，5-dimethylthiazol-2yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide］溶解于PBS中（浓度为5mg/ml），过滤消毒，并去除不溶性小颗粒。然后在每孔100μl培养液中加入10μl MTT溶液（5mg/ml），进行实验的培养板在37℃培养箱中培养4h，加入和培养液等量的酸———异丙醇（异丙醇中含0.04N盐酸）至每个培养孔中，彻底混匀，室温中放置1h待蓝黑色的颗粒完全溶解后，在酶标仪波长570nm波长测定。一般在加入异丙醇后1h内测完。
1.4 氧化指标的检测
1.4.1 SOD活力测试 取细胞培养液150μl进行检测，具体方法按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行测试。
1.4.2 MDA含量测定 取细胞培养液0.2ml进行检测，具体方法同上。
1.4.3 GSH含量测定 取细胞培养液0.03ml进行检测，具体方法同上。
1.5 基因表达检测（RT-PCR法）
1.5.1 总RNA抽提 采用Trizol试剂提取细胞总RNA方法 ［3］ 。
1.5.2 引物设计 ［4～6］
iNOS5'-ACAACGTGGAGAAAACCCCAGGTG-3'（正义链）5'-ACAGCTCCGGGCATCGAAGACC-3'（反义链）扩增片段为557bp G 3 PD 5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAAC-3'（正义链）5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'（反义链）扩增片段为100bp
1.5.3 图像处理与统计方法 RT-PCR结果采用计算机凝胶图像分析系统（VDS）扫描，求得每组样本的待测产物与其自身G 3 PDmRNA的吸光度值作内参比，进行相对半定量分析。设对照组样本/G 3 PD为100%，则实验样本mRNA下调百分比（%）=实验样本吸光度值/对照组样本吸光度值×100%。其余数据均采用SPSS8.0系统进行方差分析。
2 结果
2.1 细胞存活率的测定（MTT比色分析法） 由表1所示:与正常对照组比较，模型组有显著降低（ △△ P<0.01）;与模型组比较，调心方组和乙酰半胱氨酸组有显著升高（ ** P<0.01）。
表1 细胞的存活率（略）
注:与正常对照组比较 △△ P<0.01;与模型组比较 ** P<0.01。
2.2 细胞SOD活性的变化 由表2所示:与正常对照组比较，模型组有显著降低（ △△ P<0.01）;与模型组比较，调心方组有明显升高（ * P<0.05），乙酰半胱氨酸组有显著升高（ ** P<0.01）。
表2 细胞SOD活性的变化 （略）
注:与正常对照组比较 △△ P<0.01;与模型组比较 * P<0.05， ** P<0.01。
2.3 细胞MDA含量的变化 由表3所示:与正常对照组比较，模型组有显著升高（ △△ P<0.01）;与模型组比较，调心方组、乙酰半胱氨酸组有显著降低（ ** P<0.01）。
表3 细胞MDA含量的变化 （略）
注:与正常对照组比较 △△ P<0.01;与模型组比较 ** P<0.01。
2.4 细胞GSH含量的变化 由表4所示:与正常对照组比较，模型组有显著降低（ △△ P<0.01）;与模型组比较，调心方组、乙酰半胱氨酸组有显著升高（ ** P<0.01）。
2.5 iNOSmRNA表达的变化 由表5所示:与模型组比较，调心方组、乙酰半胱氨酸组表达分别下降为37.56%、26.67%。
2.6 iNOS RT-PCR产物琼脂糖交电泳结果 见图1。
2.7 G 3 PD RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 见图2。
表4 细胞GSH含量的变化 （略）
注:与正常对照组比较 △△ P<0.01;与模型组比较 ** P<0.01。
表5 细胞iNOS mRNA表达的变化（略）
图1 iNOS RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳 M:Marker 1:正常对照组 2:模型组 3:调心方组 4:乙酰半胱氨酸组（略）
图2 G 3 PD RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳（略）
3 讨论
脑特别易于受到氧应激和活性氧损伤，因为神经元葡萄糖代谢率高，与其他细胞相比，神经元由线粒体生成O -2 量增多，神经元的谷胱甘肽含量较低，以及只含有中等量的抗氧化酶;神经元富含对自由基敏感的多不饱和脂肪酸;脑某些区域过渡金属含量较高。特别是在神经纤维缠结中，还发现了氧化应激的终产物如:丙二醛、过氧化亚硝酸盐、羰基，进一步的糖化终末产物、超氧化物歧化酶-1和血红素氧合酶-1;Tau蛋白由于富含赖氨酸使它对氧化损伤特别敏感，易于受到脂质过氧化作用以及糖化作用生成的羰基化合物的修饰，破坏神经元纤维的运输。近几年研究发现，氧化应激可以使溶解Aβ聚合生成不溶性Aβ性斑。在加入金属催化的氧化系统体外实验中，发现可溶性Aβ聚集，而抗氧化剂能抑制这种聚集。这些结果表明自由基可引起Aβ聚合，结果导致淀粉样斑块形成 ［6］ 。许多证据表明，氧化反应在AD发生过程中起着十分重要的作用 ［7］ 。氧化损伤可能是AD中神经细胞功能障碍的早期标志之一 ［8］ 。目前比较肯定的用于研究AD（主要是胆碱能神经系统）的体外细胞模型主要有3种:原代培养的海马、皮层、基底前脑神经细胞、PC12细胞和海马HT22细胞株。PC12细胞在培养过程中以其易获得性和细胞均一性而成为神经科学离体研究中的重要工具细胞，并用于研究多种神经系统疾病，如AD、帕金森病等。H 2 O 2 是一种强氧化剂，它能穿透细胞膜使细胞内反应性氧自由基产生增加。本课题研究发现，PC12细胞经H 2 O 2 处理后，模型组A 570nm 值显著低于正常组，表明细胞受到损伤或部分已经死亡，但当预先加入调心方和乙酰半胱氨酸时，A 570nm 值较之于模型组显著升高，表明PC12细胞损伤明显减弱，活细胞增多。
SOD、GSH对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它们能清除超氧阴离子自由基和过氧化氢等，保护细胞免受损伤，是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。MDA是脂质过氧化的产物，它的含量可反映体内脂质过氧化的程度 ［9，10］ 。本课题研究显示，调心方组和乙酰半胱氨酸组与模型组比能提高SOD活力、GSH的含量和降低MDA的含量，这提示中药调心方具有清除自由基，抑制脂质过氧化，从而提高细胞的抗氧化能力。
NOS催化L-精氨酸（L-Arg）降解为胍氨酸并释放NO。目前认为，NOS至少包括3种亚型，均由相应基因控制［11］ 。其中，神经元型（nNOS）和内皮细胞型（eNOS）为组成型表达，生理状态下保持低水平的NO生成;而诱导型（iN-OS）在生理状态下不表达或表达极微，只是在炎症、损伤等病理条件下，由于内毒素、细胞因子及活性氧等物质的刺激作用而激活 ［12］ 。nNOS和eNOS生成NO的量由细胞内钙离子水平直接调控，是酶蛋白水平的调控，反应迅速、产生的NO量小，在信息传递通路中起重要作用;而iNOS是基因转录水平的调控，产生的NO量大且持续时间长 ［13］ 。
过量的NO介导和放大氧化应激、炎症级联、兴奋性毒性反应，损伤蛋白质、核酸和脂质膜，导致神经元坏死或凋亡 ［14，15］ ;过量的NO还可通过抑制能量代谢促进APP异常断裂，进一步生成Aβ ［16］ ，加剧毒性作用，促进NFTs及SP的形成，并使AD病理变化进行性发展。本课题研究结果显示，PC12细胞在H 2 O 2 诱导下iNOSmRNA表达;调心方组、乙酰半胱氨酸组与模型组比能下调iNOSmRNA表达，提示调心方组能够减少NO生成。
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作者单位:200032上海市中医老年医学研究所