微囊化PC12细胞移植治疗帕金森病的实验研究

Lu Shengqing　Zhang Kecheng　Shi Jun　He Jiaquan　Wu Ming, et al

　　（Department of neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037）

　　Objective　To investigate a newer method for treatment of Parkinson disease (PD).Methods A newer method of immunoisolation (microencapsulation) was utilized for encapsulation of dopamine-secreting PC12 cells, and the cells were implanted into the brains of Parkinson disease rats. And then, we observed the change of apomorphine-induced rotational behavior in PD rats. The quantities of dopamine (DA) in the area of transplantation were evaluated by high performance liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-EC). Tyrosine hydroxylase (TH) antibody immunohistochemistry stains of the cells in the implanted area were also proceeded.Results The apomorphine-induced rotational behavior of PD rats reduced significantly, the quantities of DA in the implanted area were increased much more than the control area at different times. At the same time, the lethal tumor formation was observed in unencapsulated PC12 cells implantation. The microcapsules in the PD rats brains were intact and TH immunopositive PC12 cells could survive for 3 months postimplantation.Conclusion Implantation of microencapsulated PC12 cells for treatment of Parkinson disease might be a new and effective method that could avoid the shortcoming of agents, stereotactic therapy, and implantation of embryonic brains.

　　Key words　microencapsulation; PC12 cell; implantation; Parkinson disease

　　帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统(CNS)退行变性疾病，其病理特征主要为中脑黑质纹状体通路多巴胺(dopamine,DA)能神经元进行性变性死亡，表达的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)减少或活性降低，造成纹状体内DA含量减少，因而出现静止性震颤，运动减少，肌强直等临床症状^［1］。目前治疗方案较多，如口服DA前体物质左旋多巴(L-dopa)，脑内移植能分泌DA的细胞或组织，以及立体定向手术治疗等。但是，各种方式都有其优劣性。药物治疗可缓解症状，无法阻止病情发展，并有一定的副作用。自体肾上腺髓质脑内移植的动物实验及临床研究表明效果并不满意，其原因是由于移植细胞存活较差(仅有0.5%～1.0%细胞存活)，完全替代宿主提供DA不可能。胚胎脑移植涉及到伦理道德问题，同时还有移植后的免疫排斥反应。PC12细胞(rat adrenal pheochmocytoma)是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，能分泌DA和NE(去甲肾上腺素)等神经递质^［2］。本研究利用该特性，将其微囊包裹(microencapsulated)后移植入脑内，补充纹状体内DA的不足，以期达到纠正和改善临床症状的目的。免疫排斥是组织和细胞移植中最大障碍，而免疫隔离可避免免疫排斥。其原理是：采用一些合适的材料，将移植物与宿主免疫系统隔离开，避免排斥反应而长期存活，并释放生物活性分子如激素和神经递质等发挥作用。微囊膜是目前应用较广的一种免疫隔离技术。该膜能允许营养物质、电解质、氧气等低分子物质(相对分子质量＜30 000)自由通过，而大分子物质(相对分子质量＞150 000)如免疫球蛋白、免疫细胞等不能通过，从而避免了排斥反应，并可利用移植物分泌的小分子活性物质发挥生物效应。

　　1　材料和方法

　　1.1　细胞培养　PC12细胞(上海细胞所细胞库提供)用含10%(体积分数)胎牛血清，90%(体积分数)DMEM(Gibco,USA)培养液，置37℃、5%(体积分数)CO₂培养箱内培养，每3天(d)换液。

　　1.2　微囊制作　微囊按照Chang等^［3］提出的方法进行。将体外培养生长良好的PC12细胞制成细胞悬液，倒入30 g/L灭菌海藻酸钠溶液内混匀，通过自制微囊形成器，滴入22 g/L氯化钙溶液内，再用左旋多聚赖氨酸(PLL，相对分子质量25 000，Sigma, USA)和2-氮环己烷基乙基硫酸(CHES， Sigma, USA)处理多次，形成直径约0.8 mm的微囊。以同样方法制作未包裹PC12细胞的空微囊足量备用。

　　1.3　动物模型及分组　本校动物所的健康Wistar大鼠50只，160～200 g，雌雄不拘，PD大鼠模型按本科室建立的方法进行^［4］。将35只成功PD模型随机分组：(A) 对照组15只；(B) 未行微囊包裹PC12细胞移植组5只； (C) 微囊化PC12细胞移植组15只。

　　1.4　移植分组　(A) 对照组：　立体定向方法按每只10个空微囊(无PC12细胞)移植到PD大鼠纹状体。(B) 未行微囊包裹PC12细胞移植组：　同样方法将每只20 μL PC12细胞悬液移植到PD鼠纹状体。 (C) 微囊化PC12细胞移植组：　包裹PC12细胞的微囊移植到纹状体(10个/只)。

　　1.5　检测指标　移植后2周、1月、3月分别进行阿扑吗啡诱发旋转行为试验。A和C组PD鼠按上述时相点迅速处死动物(各组每次5只)，于冰碟上分离移植区脑组织，参照叶惟泠法^［5］以高效液相色谱-电化学法测定多巴胺含量。并将移植3月后大鼠脑解剖，取出数个微囊。在无菌条件下剪破微囊，内含细胞用酪氨酸羟化酶(TH)抗体(1∶1250，Boehringer Mannheim, Germany)免疫组织化学染色，LSAB试剂盒检测(DAKO, Denmark)。B组于术后1月解剖大鼠移植区，取标本进行HE染色。

　　1.6　数据处理　据采用本校编制统计程序进行单因素方差分析和t检验，数据均以

　　2　结果

　　2.1　PD鼠旋转行为测试　大鼠旋转行为是反映黑质纹状体多巴胺能神经元变性死亡的重要指标。移植后不同的时相点，C组大鼠旋转次数较空微囊的A组明显减少，差异有统计学意义。B组大鼠的旋转行为在移植术后1月也有明显改善(表1)。

表1　微囊化PC12细胞移植对PD鼠旋转行为的影响

　　Table 1　The effect of implantation of microencapsulated PC12 cells

　　on the rotational behavior of PD rats (r/min)

P＜0.05 compared with control group

　　2.2　移植区多巴胺含量测定　A组和C组大鼠分别于移植后2周、1月、3月杀死取标本，对PD鼠脑内移植空包囊和含PC12细胞的微囊，同批进行多巴胺含量测定，发现C组多巴胺含量明显高于A组，差异有统计学意义(表2)。B组大鼠中4只在移植后1月表现出颅内肿瘤的症状及体征，估计可能有肿瘤形成，遂处死大鼠用于形态学研究，未检测其多巴胺含量。

表2　微囊化PC12细胞移植后移植区DA含量变化

　　Table 2　The contents of DA in the implanted area postimplantation of

　　microencapsulated PC12 cells (brain tissue，ng/g)

P＜0.05 compared with control group

　　2.3　形态学观察　A组和C组大鼠分别于移植后2周、1月、3月杀死，取脑组织时可见完整的微囊，但与移植前形态比较稍有改变，呈类似椭圆形。取C组微囊数个，无菌条件下剪破，取出内含细胞，继续培养4 d，然后进行TH抗体免疫组化染色，培养的细胞多数生长良好，均表现为TH阳性。B组大鼠处死后解剖移植区，可见新生物形成，取部分新生物进行HE染色，病理证实有致死性肿瘤形成。

　　3　讨论

　　PD作为一种老年性中枢神经系统退行性病变，其病因学尚不完全清楚，但其病理基础是中脑黑质纹状体多巴胺能神经元进行性变性死亡。学者们针对其病理改变进行了多方面研究，如药物治疗，立体定向毁损丘脑腹外侧核团治疗以及移植治疗，而后者又包括移植胎脑黑质、肾上腺髓质、颈交感神经节细胞等。药物治疗和立体定向手术治疗在临床上应用了几十年，其疗效有肯定的一面，但远期疗效仍不尽如人意^［6］。而胎脑移植、肾上腺髓质及颈交感神经节细胞移植均有弊端^［7,8］。PC12细胞作为肿瘤细胞系，有“不死性”且有分泌功能，其释放的DA可补充黑质纹状体DA的含量。本研究即从其分泌功能出发，用以尝试一种新的有效的治疗PD的方案，即微囊化PC12细胞移植治疗PD。该实验根据Chang^［9］免疫隔离技术原理，制成了能将PC12细胞与宿主的免疫系统隔离的新型微囊膜。

　　众所周知，同种异体或跨物种组织和细胞移植的最大障碍是免疫排斥反应。以往的研究认为脑是免疫特免器官，晚近研究逐渐否定了该理论。为了避免免疫排斥反应，长期以来人们进行了多方面的研究，主要是移植前组织配型及移植后免疫抑制剂应用等。而微囊技术作为一种免疫隔离技术，同样可避免免疫排斥，并且对宿主无毒性反应^［10］。本研究发现：采用海藻酸钠和左旋多聚赖氨酸制成的微囊膜(APA膜)，性能稳定，有一定的强度，以其包裹的PC12细胞能够在PD鼠脑内存活，获取营养，释放DA。PC12细胞存活时间可达12周，12周后收集微囊取出PC12细胞，继续培养后细胞生长良好，仍能表达TH(经TH抗体免疫组化结果得以证实)。从PD鼠的旋转行为来看，移植含PC12细胞的微囊，对改善其旋转行为效果明显(P＜0.05)。中脑黑质纹状体DA含量测定是衡量治疗PD有效与否的最客观的指标。我们采用高效液相色谱电化学法测定DA含量，有力地证实了微囊化PC12细胞所释放的DA能补充黑质纹状体DA不足(P＜0.05)。本实验还发现：未行微囊包裹的PC12细胞移植有致死性肿瘤形成，这可能与己建株的肿瘤细胞系的“不死性”有关，它们如何逃避宿主抗肿瘤免疫的机制尚需进一步研究。由于肿瘤形成，其释放的DA对改善PD的旋转行为仍然有效。但我们不能只顾及其短期有效性而忽视其致瘤性。因此，PC12细胞移植治疗PD，微囊包裹仍然必不可少。

　　总之，多种治疗PD的方案中，微囊化PC12细胞移植可解决跨物种移植存在的免疫排斥反应，能避免类似肾上腺髓质移植时细胞存活性差的弊端，不存在胎脑移植的伦理道德问题，不会出现药物治疗和立体定向手术的并发症，至少能为将来临床治疗PD提供实验依据。

(致谢：本实验得到重庆医科大学何军讲师及本院病理科许建平讲师的鼎力相助)

　　 参考文献

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　　3，Chang PL, Hortelano G, Tse M, et al. Growth of recombinant fibroblasts in alginate microcapsules. Biotechnol Bioeng, 1994, 43:925-933

　　4，杨 辉，张可成，蔡文琴.AM 脑内移植后 PD鼠纹状体内单胺类神经介质及D2受体变化的研究.中华实验外科杂志，1995，12：225-227

　　5，叶惟泠.用高效液相色谱-电化学检测法快速、灵敏分析生物样本中的单胺类递质及其代谢产物.生理学报，1987，39(4)：412-419

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　　7，Date I. Parkinson disease, trophic factors, and adrenal medullary chromaffin cell grafting:basic and clinical studies. Brain Res Bull, 1996, 40:1-19

　　8，Date I, Ohmoto T. Neural transplantation and trophic factors in Parkinson disease:special reference to chromaffin cell grafting, NGF support from pretransected peripheral nerve and encapsulated dopamine-secreting cell grafting. Exp Neurol, 1996, 137:333-344

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　　10，Petruzzo P, Cappai A, Ruiu G, et al. Cell microencapsulation:a new method. Transplant Proc, 1994, 26(6):3507-3508

(1999-01-28 收稿)