点击显示 收起
Determination of dextrometheorphan in human plasma by HPLC-FLD
LIU Qing，XIONG Xun-yu，GAO Ying-chun，et al.
Research and Engineering Center of Chinese Herb Moderniza-tion，Shannxi，Xi'an710061，China
【Abstract】 Objective To establish a valid and sensitive high performance liquid method for determination of dex-trometheorphan in human plasma.Method Plasma sample was extracted with mixture of hexane and iso-propane（99∶1），and the content of dextrometheorphan in human method is determined by external standard sample.Result the linear range of dextrometheorphan is0.312～26.6μg/L，and the low detected limit is0.106μg/L，the RSD%of high，middle，and low content for reproduction experiment are also lower than3.3，and the RSD%of precision are not more than4.7，and the recoveries are all more than101.4.Conclusion This method is simple，sensitive，and easy to operate.
【Key words】 dextromethorphan hydrobromide;HPLC;FL
氢溴酸右美沙芬（dextromethorphan hydrobromide，DM）是一种中枢性镇咳药，通过抑止延髓咳嗽中枢而产生作用，其镇咳作用与可待因相当，但无镇痛作用及成瘾性，临床主要用于感冒及其他各种原因引起的咳嗽。由于氢溴酸右美沙芬在体内代谢迅速而广泛 ［1，2］ ，故其在体内代谢后母体血药浓度较低，为直接测定血浆中母体血药浓度带来一定困难。国内外常通过测定其浓度较高的活性代谢产物去甲右美沙芬的血药浓度，来对该药的药代动力学作出评价 ［3，4］ 。本文研究并建立了测定人体血浆中氢溴酸右美沙芬的血药浓度的HPLC-FLD方法，该方法简便、快速，易于操作。
1 仪器及试剂
1.1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪（1100型二元梯度泵，7725i手动进样器，1100型荧光检测器，1100型柱温箱，Chemistation化学工作站）;pH计（Mettler Toledo320）;Sartorius万分之一电子天平;Maxia超纯水机;
1.2 试剂 氢溴酸右美沙芬对照品（中国药品生物制品检定所，批号100201-199901），甲醇、乙腈均为色谱纯（Fisher公司），水为实验室自制去离子水，有机提取相为正己烷和异丙醇混合溶液（正己烷∶异丙醇=99∶1，V∶V）其它试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 空白血浆的制备 精密加入碱液0.5ml漩涡振荡1min，精密加入有机相5.0ml，6000r/min离心2.0min，精密吸取有机相4.0ml，加入200μl50mM磷酸，备用。
2.2 对照品溶液的配制 取人混合空白血浆0.5ml，置于1.5ml试管中，加适量氢溴酸右美沙芬标准溶液，按空白血浆处理方法处理，制成浓度为26.6μg/L的对照品溶液。
2.3 样品测定
2.3.1 色谱条件 流动相:A=20mmol/L磷酸二氢钠水溶液（磷酸调pH为3.0）;B=甲醇，A∶B=52∶48色谱柱:Agi-lent ODS C 18 ，150×4.6mm5μm。柱温:30℃。流速:0.8ml/min。检测波长:激发波长，280nm;发射波长，330nm。进样量:20μl。
此色谱条件下，人混合空白血浆、氢溴酸右美沙芬标准品溶液和含药血浆色谱图见图1、2、3。
2.3.2 血样处理 精取待测样品血浆1.0ml于10ml圆底离心管，精密加入碱液0.5ml漩涡振荡1min，精密加入有机相5.0ml，6000r/min离心2.0min，精密吸取有机相4.0ml，加入200μl50mM磷酸，取水相20μl进样分析。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线的制备 取人混合空白血浆0.5ml共7份，分别置于1.5ml试管中，加适量氢溴酸右美沙芬标准溶液，使血浆中氢溴酸右美沙芬的浓度依次分别为26.6，13.3，5.32，3.99，1.33、0.615和0.312μg/L，按照2.3.2项下样品制备方法制成供试品溶液，在拟定色谱条件下，进样20μl，测定峰面积。以氢溴酸右美沙芬血浆浓度C（μg/L）对色谱峰面积（A），线性回归，得标准曲线方程:C=0.0174A+0.0401，r=0.9999（n=7），线性范围为0.312～26.6μg/L。
2.4.2 方法回收率试验 取人混合空白血浆三份，加入适量的氢溴酸右美沙芬标准溶液，分别配成低、中、高三个浓度的伪麻黄碱血浆样品2.66，5.32，13.3ng/ml，按样品测定方法各测定含量6次，由上述标准曲线计算测得浓度，计算方法百分回收率分别为:108.8±2.81，103.1±3.70，101.4±1.97。
2.4.3 日内和日间精密度试验 取人混合空白血浆3份，加入适量氢溴酸右美沙芬标准液，配置成高、中、低浓度分别为2.66，5.32，13.3μg/L血浆样品，在一天内按样品测定法重复测定6次，求得日内精密度RSD%分别为2.3，3.3，1.8;将上述3个浓度的样品在8天内陆续各重复测定6次，求得日间精密度RSD%分别为4.7，2.8，1.6。
2.4.4 样品稳定性试验 将2.66，5.32和13.3μg/L高、中、低三个浓度的氢溴酸右美沙芬血浆样品分别置于-20℃冰冻24h后自然解冻，按前述方法测定氢溴酸右美沙芬血浆浓度变化，完全解冻后将样品重新冷冻24h。测定6个周期，计算冻融1周后与冻融前样品浓度百分比率分别为85.1，90.6，93.5。
2.4.5 样品测定结果 20名健康受试者空腹口服羧甲斯坦1.0mg，分别于服药后0.0，0.33，0.66，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0h静脉取血5.0ml，15000r/min离心10min，分出血浆。取血浆1.0ml，按2.3.2项下方法制备样品，在拟定色谱条件下进样分析，以血药浓度对时间作图（见图4）。
（图4见封三）（略）
3 讨论
3.1 该方法灵敏度高，重现性好，回收率符合要求，可作为氢溴酸右美沙芬在人血浆中血药浓度的测定方法。
3.2 文献报道氢溴酸右美沙芬最佳检测波长为:激发波长280nm，发射波长308nm，笔者经过反复试验验证后，发现在此波长条件下，空白血浆中有一内源性干扰物质无法消除，调整发射波长为330nm。试验结果表明，在本文试验条件下，空白血浆无干扰物质存在，检测限符合要求，故选此波长为检测波长。
【参考文献】
1 Bambart JW.Determination of dextrometheorphan in serum by gas chro-matography.J Chromatography，1979，163:390.
2 Ramachander G，Williams F D，Emele J F.Determination of dex-trometheorphan in plasma and evaluation of bioavailability of dex-tromethorphan hydrobromide in humans.J Pharm Sci，1977，66:1047.
3 Silvasti M，Karttunen P，Tukiainen H，et al.Pharmacokinetics of dex-trometheorphan and dextrophan:a single dose comparison of three prepa-ration in human volunteers.Int J Clin Pharm Ther Tox，1987，25:493.
4 刘荔荔，王卓，张纯，等.氢溴酸右美沙芬口服液在人体内的生物利用度.中国医院药学杂志，1993，13（7）:291.
* 基金项目:陕西省自然科学基金项目（2000H10）
作者单位:710061陕西西安，西安交通大学中草药现代化研究工程中心（△ 通讯作者）
710061陕西西安，西安交通大学药学院
710032陕西西安，第四军医大学口腔医院