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沙尔威辛（salvicine, SAL）是中国科学院上海药物研究所从药用植物南鼠尾草中提取分离，再经修饰优化而得到的一种全新结构二萜醌类化合物。SAL对体外培养肿瘤细胞有显著的细胞毒作用［1］；并能诱导培养的K-562白血病细胞和SGC-7901胃腺癌细胞发生凋亡［2］；对小鼠S-180肉瘤、Lewis肺癌和人肺癌裸小鼠移植瘤A-549、LAX-83有明显的生长抑制作用［3］。SAL具有良好的抗耐药作用，对三株耐药细胞的平均耐药系数为1.2，远远低于长春新碱（VCR）的86.65，阿霉素的233.2，依托泊甙（etoposide, VP16）的53.7。SAL的抗耐药作用可能主要通过下调多药耐药基因（multidrug resistant, MDR）mRNA和p糖蛋白的表达（未发表资料）。SAL目前已完成全部临床前试验，即将进入一期临床研究，很有希望成为具有我国自主知识产权的抗肿瘤新药。
进一步的抗肿瘤机制研究表明，salvicine是一新结构类型的DNA拓扑异构酶Ⅱ（DNA topoisomerase Ⅱ,TOPO Ⅱ）抑制剂［4］。SAL能够在无细胞体系中抑制TOPO Ⅱ的催化活性，并且能够捕获TOPO -DNA断裂复合物。然而，还不清楚SAL是否通过抑制TOPO Ⅱ而发挥抗癌作用。因此需要细胞水平上的直接证据证实TOPO Ⅱ是否为SAL细胞毒作用的靶点。在本实验中，应用一个酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）遗传系统探讨TOPO Ⅱ是否为SAL在酵母细胞内的主要作用靶点及其作用方式。
1 材料与方法
1.1 药物 VP16购自浦东制药厂，喜树碱（camptothecin, CPT）购自湖北黄石制药厂，SAL由中国科学院上海药物研究所植化室张金生教授提供。SAL用DMSO配制成10-2mol/L的储存液，临用前用生理盐水稀释到所需浓度。
1.2 酵母株 四株酵母由Vanderbilt大学Neil Osheroff教授惠赠。父本JN394的基因型为ura3-52、leu2、trp1、his7、adel-2、ISE2、ras52：LEU2［5］。其他三个JN394的突变株分别为：TOPO Ⅰ基因缺失的JN394 top-［5］；野生型的TOPO Ⅱ基因被温度敏感型取代的JN394t2-1［6］；对某些药物耐受的JN394t-5［7］。这三株酵母的其他性状与JN394相同。
1.3 生长抑制实验 JN394、JN394top1、JN394t2-1和JN394t2-5四株酵母的生长抑制实验采用克隆形成实验［8］。简述如下：酵母细胞于25℃培养于YPDA或全合成（培养JN394top1-细胞时）培养基，在部分实验中，酵母细胞也被培养于30℃。调节处于对数生长期的细胞的浓度为106/ml，加入不同浓度的药物或与药物等体积的生理盐水；继续培养24h。用新鲜的YPDA培养基稀释酵母培养物5000倍，取20μl涂布于YPDA平板，每一培养物涂三块平板。把平板置于25℃培养3～4天后，对存活的菌落进行计数。酵母的相对存活率计算如下：加药菌落数/不加药菌落树×100％。每个实验均重复2～3次，存活率表示各次实验的平均值或平均值±标准差。
2 结果
2.1 TOPO Ⅰ不是SAL细胞内的作用靶点 以往的无细胞体系的实验表明，SAL不能抑制TOPO Ⅰ的催化活性。在本实验中应用JN394top-酵母株在细胞水平上证实这一结果。JN394top-细胞的TOPO Ⅰ活性完全缺失。由于TOPO Ⅰ活性对酵母细胞的生存不是必不可少的，JN394top-可以作为一个很好的模型研究化合物是否以TOPO Ⅰ为作用靶点。实验结果所示，母本细胞JN394对CPT非常敏感，在6.25μmol/L CPT作用下，细胞的存活率几乎降至0；然而，在相同浓度的CPT作用下，JN394top的生长几乎不受影响。相反的，JN394top并不显示出对SAL的耐受，SAL对母本细胞和TOPO Ⅰ缺失的细胞的作用强度相似。这一现象证实了在无细胞体系得到的结果，表明TOPO Ⅰ不是SAL细胞内的作用靶点。
2.2 SAL以TOPO Ⅱ毒剂的方式作用于酵母细胞 分别在无细胞体系和细胞水平上排除了SAL通过TOPO Ⅰ作用的可能，SAL细胞毒作用的机制存在一下三种可能：(1)TOPO Ⅱ是SAL细胞毒作用的主要靶点，SAL通过捕获TOPO Ⅱ-DNA断裂复合物而杀死细胞；(2)SAL也是通过TOPO Ⅱ作用，细胞毒作用是通过抑制TOPO Ⅱ总的催化活性；(3)TOPO Ⅱ不是SAL细胞毒作用的靶点。
以上所述的三种可能性可以通过应用JN394t2-1酵母株而加以区分。JN394t2-1细胞表达温度敏感型的TOPO Ⅱ蛋白以取代野生型的5％～10％。因此，如果SAL以TOPO Ⅱ毒剂的方式作用，酶活性的下降将显著减缓SAL的细胞毒作用。反之，如果SAL的细胞毒作用与其抑制TOPO Ⅱ总的催化活性有关，下调的酶活性将显著提高SAL的细胞毒作用。最后，如果SAL的细胞毒作用不是由TOPO Ⅱ介导的，那么TOPO Ⅱ活性的降低将不会影响细胞对SAL的敏感性。
SAL对培养于25℃的JN394t2-1细胞显示了良好的细胞毒作用。在12.5μmol/L SAL作用下，t2-1的相对存活率为74.8％；当SAL的浓度升至50μmol/L时，相对存活率进一步降至31.6％；SAL的浓度为100μmol/L时，约90％的细胞被杀死。与阳性对照药VP16相比较，VP16在这个实验中的活性更好。当t2-1细胞与100μmol/L VP16共培养24h后，几乎检查不到存活的细胞克隆。然而，在30℃检测SAL的细胞毒作用时，得到截然不同的结果。SAL在此温度下对t2-1细胞没有明显的生长抑制作用；事实上，在6.25μmol/L SAL作用下细胞的存活率较之对照有略微上升。用VP-16处理细胞也得到了类似的结果。T2-1细胞在30℃时对CPT依然相当敏感，而CPT的细胞毒性依赖于细胞的增殖状态以及DNA性相似，提示SAL对t2-1细胞活性的降低并不是由于药物吸收或在细胞内的代谢在30℃时发生变化。综上所述，随着细胞内TOPO Ⅱ活性的降低，SAL的细胞毒作用显著下降，表明TOPO Ⅱ是SAL细胞内的主要作用靶点，SAL的细胞毒作用主要源自于其捕获TOPO Ⅱ-DNA断裂复合物的能力。
2.3 SAL与VP16可能作用于TOPO Ⅱ上相似的位点 以上的实验表明TOPO Ⅱ是SAL的作用靶点之一，SAL通过使TOPO Ⅱ变成细胞的毒剂而杀死细胞。这类化合物包括VP16、安呀啶、喹诺酮类衍生物［9］、以及最近报道的TAS103［10］。为研究在TOPO Ⅱ与以其为靶点的药物的相互作用中发挥重要作用的TOPO Ⅱ的功能域，Nitiss等建立了一株表达top2-5突变蛋白的酵母株，即JN394t2-5。T2-5蛋白对温度非常敏感，在25℃时，它具有野生型TOPO Ⅱ的全部活性，但是对一些TOPO Ⅱ毒剂高度耐受如AMSA和VP16［8］；在30℃时，t2-5丧失活性，细胞在此温度下不能存活。在本实验中，应用这一酵母株探究SAL是否与其他抗TOPO Ⅱ剂作用于TOPO Ⅱ上相似的位点。在SAL或VP16的作用下，JN394t2-5的存活率并没有受到显著影响，甚至SAL的浓度升至100μmol/L。实验结果表明，t2-5的突变使细胞对VP16和SAL均产生了耐受，提示这两个化合物可能有着类似的TOPO作用位点。
3 讨论
TOPO Ⅱ是一种重要的核酶，在DNA复制、转录，DNA复制后染色单体的解离、染色体结构的组织等方面发挥这不可或缺的作用。由于肿瘤细胞快速增殖的特性，其TOPO Ⅱ的含量及活性远远高于正常体细胞，因此TOPO Ⅱ成为一个著名的抗癌药物的作用靶点。SAL使一种新的TOPO Ⅱ抑制剂并且具有显著的抗肿瘤活性。我们以往的实验结果表明，SAL能够在无细胞体捕获TOPO -DNA断裂复合物，可能是其抗癌作用的基础。然而，还没有证据证明SAL捕获的TOPO Ⅱ介导的DNA断裂导致细胞死亡。在本章实验中，应用一个酵母遗传系统，以便能在细胞内控制TOPO Ⅱ的表达水平，从而证明已在无细胞系统中得到的结果。
实验结果表明，TOPO Ⅰ活性缺失的酵母细胞对SAL的敏感性与母本细胞相似，提示SAL并不是通过干扰TOPO Ⅰ的活性而杀死细胞。另一方面，细胞对SAL的敏感性与其细胞内的TOPO Ⅱ活力密切相关。如果细胞内的TOPO Ⅱ活性高，那么其对SAL则相对敏感；反之，如果细胞内的TOPO Ⅱ活性低，细胞则表现出对SAL的耐受。在25℃时，SAL对t2-1细胞显示出良好的细胞毒作用，而在30℃，SAL则对其生长没有影响，这一现象同推测的SAL可能的作用模式是抑制的。由于SAL能够捕获TOPO -DNA断裂复合物，如果细胞内TOPO Ⅱ的活力高对SAL就相对敏感，细胞内TOPO Ⅱ的活力下降就会对SAL产生耐受。总之，这些结果支持了SAL通过促进TOPO Ⅱ介导的DNA断裂的观点。
野生型TOPO Ⅱ被t2-5突变蛋白取代的酵母细胞对一些TOPO Ⅱ抑制剂如AMSA和VP16产生耐受。Top2-5蛋白的突变发生在对真核细胞TOPO Ⅱ功能重要的区域。实验结果表明，JN394t2-5细胞对SAL和VP16均表现出高度耐受，表明SAL可能与VP16共享TOPO Ⅱ上的某些作用位点。我们以往的实验也证实SAL和VP16有相同的作用模式，如二者都能通过抑制TOPO Ⅱ连接断裂的DNA的活性而促进此酶介导的DNA断裂。T2-5细胞对SAL的耐受同时也支持了TOPO Ⅱ是SAL细胞内作用靶点的观点。
总之，通过应用一个酵母遗传系统，表明TOPO Ⅱ是SAL主要的作用靶点，SAL主要通过捕获TOPO Ⅱ-DNA断裂复合物而杀死癌细胞。这一结论有助于了解SAL抗癌作用的机制，并且为设计SAL类似物提供了有益的线索。
【参考文献】
1 Qing C, Zhang J, Ding J. Acta Pharmacol Sin, 1999,20:297-302.
2 Qing C, Zhang J, Ding J.Anticancer Drugs, 2001,12:51-56.
3 Zhang J, Ding J, Tang Q， et al. Bioorg Medi Chem Lett,1999,9:2731-2736.
4 Meng LH, Zhang JS, Ding J. Biochem Pharmacol(submitted).
5 Nitiss J, Wang JC.Proc Natl Acad Sci USA, 1988,85:7501-7505.
6 Elsea SH, Osheroff N, Nitiss JL.J Biol Chem, 1992,267:13150-13153.
7 Nitiss JL, Liu YX, Hsiung Y. Cancer Res, 1993,53:89-93.
8 Jensen LH, Nitiss KC, Rose A，et al. J Biol Chem, 2000,275:2137-2146.
9 Robinson MJ, Martin BA, Gootz TD，et al. J Biol Chem, 1991,266:14585-14592.
10 Byl JA, Fortune JM, Burden DA，et al. Biochemistry,1999,38:15573-15579.
(编辑：齐 永)
作者单位： 200031 上海，中国科学院上海药物研究所肿瘤药理实验室