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【摘要】 收集23株灵芝栽培菌种为材料, 从DNA水平上探讨不同产地的灵芝菌种的差异。从247个随机引物中筛选出具有较高多态性扩增检测能力的引物9条,对23株灵芝菌种进行RAPD分析。以其中的两条随机引物S17和S1005进行扩增分析可以有效鉴别大部分灵芝栽培菌种,作为分子标记。
【关键词】 灵芝; RAPD; 分子鉴别
Molecular identification of 23 ganoderma strains
LUO Lianzhong, LIN Shuqian, CHEN Jinsheng,et al.
Fuzhou Green Valley Institute of Bio-pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002,China
【Abstract】 23 Ganoderma strains were analysed by RAPD with 247 primers. The experimental results showed 9 primers could amplify the genomic DNA of all 23 ganoderma strains with effective repetitions and 22 ganoderma strains could be effectively identified using S1005 and S17 asmolecular marker.
【Key words】 ganoderma;RAPD; molecular identify
灵芝(Ganoderma lucidum)是重要的药用真菌,《中国药典》2000年版记载赤芝(G.lucidum)和紫芝(G.sinenes)可作为药用［1］;卫生部发布可用于药品的真菌菌种名单目录中,公布了灵芝3个种,即赤芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)和松杉灵芝(G.tsudae)。灵芝属已经报道了76个种［2］,其栽培菌株也比较多,但长期存在菌种混乱的问题,同种异名、同名异种现象普遍存在,缺少一个可靠的菌株鉴定手段。随着灵芝产品的深入开发,在生产中确保灵芝子实体在分类上的可靠性,建立灵芝菌栽种的保障体系尤为重要。Williams和Welsh开创RAPD技术以来,该技术在食用菌研究领域已得到广泛的应用［3,4］。笔者从全国多个研究机构和灵芝生长基地收集了23株灵菌种,运用RAPD技术对它们进行分析,从DNA水平上寻找它们的遗传差异性,为灵芝菌株鉴定和灵芝药材生产管理规范(GAP)提供分子水平上的参考。
1 材料与方法
1.1 供试菌株 供试菌株的实验编号及相应信息 见表1。
1.2 供试培养基 马铃薯200g, 葡萄糖20g,KH2PO4110g,MgSO4·7H2O 0.5g, 水100ml,pH 自然。
1.3 基因组DNA的提取
表1 供试菌株及其编号（略）
1.3.1 菌丝体培养 将灵芝菌种接种在液体培养基中,于30℃,150rpm 恒温摇床培养10天,用两层纱布过滤,蒸馏水冲洗干净后收集菌丝,置-20℃贮存备用。
1.3.2 DNA提取与检测 参照CTAB法［5］,提取DNA 样品,取5μl在0.8%琼脂糖凝胶电泳(5V/cm),EB染色,凝胶成像系统下观察DNA的电泳条带。同时用紫外分光光度计测定DNA 的浓度,分析DNA的质量。
1.4 供试菌株RAPD分析
1.4.1 试剂 本实验所用的247个10核苷酸随机引物(RAPD Primers)均从上海生工生物工程技术服务有限公司购买,其代号为: S1,S6,S7,S8,S18,S22,S23,S24,S25,S29,S31,S32,S33,S37,S38,S39,S40,S42,S43,S65,S95,S117,S134,S257,S265,S299,S409,S1326,S1327,S1332,S1334,S1339,S1～20,S141～160,S221～240,S361～380,S481～500,S1001～1020,S1161～1180,S1381～1400,S1501～1520,S2041～2026,S2101～2120。
琼脂糖、Taq酶、10×PCR缓冲液、dNTP、DNAmarker等均为大连宝生物工程公司的产品。其余生化药品均为国产分析纯。
1.4.2 RAPD扩增反应试剂组成 RAPD扩增反应体系为:DNA 1μl (100ng)、Primer 1μl ( 5pmoL/μl)、dNTP 1μl (10Lmol/each)、Taq 1μl (1U)、10×PCR缓冲液2.5μl、ddH2O补至25μl。扩增反应程序为: 92℃预变性5min,35个循环的92℃变性1min、35℃复性1min、72℃延伸2min。最后,72℃延伸10min,终止反应。
1.4.3 琼脂糖凝胶电泳 取上述PCR产物8μl点样于1.4%琼脂糖凝胶上,于0.5×TBE 缓冲液中5V/cm电泳。EB染色在Bio-Rad凝胶成像仪上照相。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果 CTAB法提取的DNA电泳条带清晰,约20kb左右,能够用于RAPD的扩增分析(见图1)。
图1 灵芝总DNA电泳图(略)
2.2 引物的筛选 在247个随机引物中,一共挑选出了9条具有理想的重复性和多态性的随机引物;S17、S18、S24、S1005、S1339、S1398、S1508、S2111、S2116。
2.3 菌株鉴定 由于实验菌株中,有些菌株间遗传关系比较近,结果没有一个引物的扩增,可以将所有菌株完全区分开来。以S17和S1005为引物,对供试的23株灵芝菌种进行扩增,共获得30个多态性片段,其长度(见表2、3)。通过这些多态性片段可以将其中22菌株区分开来。其中无法区分的有5号上海灵芝和8号惠州灵芝,其余随机引物对这两个菌种的扩增结果也完全相同,因此推断上海灵芝和惠州灵芝为同种异名。实验结果(见图2、3、4)。
图2 S1005为引物对供试菌株的扩增结果(略)
注：M道为分子量标准DL2000，1-23道为供试菌株编号
图3 S17为引物对供试菌株的扩增结果(略)
注：M道为分子量标准DL2000，1-23道为供试菌株编号
图4 23个灵芝栽培菌株的分子鉴别树状图(略)
注：（+）表示具有该扩增片段。（-）表示没有该扩增片段
表2 引物S1005对供试菌株RAPD扩增的影响(略)
注：0表示未扩增出该长度的DNA片段，1表示扩增出该长度大小的DNA片段
表3 引物S1005对供试菌株RAPD扩增的影响(略)
注：0表示未扩增出该长度的DNA片段，1表示扩增出该长度大小的DNA片段
3 讨论
传统的灵芝分类方法以形态特征为依据,其结果易受环境条件的影响。灵芝栽培菌株间的亲缘关系往往比较近,传统分类方法经常得不到理想的结果。通过RAPD技术检测、鉴别灵芝栽培菌株是以遗传物质为依据,在鉴别上具有可靠性,同时RAPD的灵敏度较高,能够鉴别亲缘关系较近的菌株。因此,RAPD对灵芝栽培菌株的鉴定结果可以作为灵芝栽培选种的重要参考。
本文通过RAPD技术成功的将收集的23个灵芝栽培菌株中的22个进行鉴别,找到各菌株的特意条带,同时经过多个随机引物的扩增分析,未能区别上海灵芝与惠州灵芝。RAPD技术存在重复性相对不稳定等特点,在对灵芝菌株进行鉴定时最好同其形态特征等相结合进行综合分析,使结果更加可靠。
【参考文献】
1 国药典委员会.中华人民共和国药典. 北京:化学工业出版社,2000,2221.
2 赵继鼎,张小青.中国真菌志(第十八卷灵芝科).北京: 科学出版社,2000,251.
3 施庆利,罗信昌.RA PD技术在木耳杂交种及原生质体融合子鉴定分析中的应用.中国食用菌,1994,12 (6)∶3-41.
4 张引芳.IMolina studies on the differentiation of lentinulaedodes strains by RAPD assay. 食用菌学报,1994,1(1)∶22-271.
5 曾凡亚,张义正.从多糖丰富的样品中制备食用真菌DNA.食用菌学报,1996,3(3)∶13-17.
(编辑：邓 锋)
作者单位： 350002 福建福州，福州绿谷生物药业技术研究所
201203 上海，中科院上海生命科学院绿谷研究院
350002 福建福州，福建农林大学生命科学院
10083 北京，北京大学医学部药理系