点击显示 收起
【摘要】 以天麻花葶为材料，采用改良SDS法对天麻DNA提取进行了研究，经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测，能得到高纯度的DNA，OD260/OD280在1.75～1.9之间，蛋白质、多糖、RNA等去除较彻底，适于进一步分析。
【关键词】 天麻；基因组DNA；DNA提取
Study on extraction of DNA of Gastrodia elata.scape in an improved SDS method
CHANG Chu-rui,WANG Xiao-li.Botany and Pharmaconoge Department of Guiyang Medical college 550004,China
【Abstract】 The DNA of Gastrodia elata.scape were extracted with an improved SDS method.The extracted DNA was examined by ultraviolet absorption test and agarose gelelectrophoresis.The results showed that the improved SDS method was suitable for DNA extraction in Gastrodia elata.The purity of the extracted DNA was very high with OD260/OD280 value of 1.75～1.9.The protein,polyhexose and RNA were eliminated completely.It could be used for analysis.
【Key words】 gastrodia elata；genome DNA；DNA extracting
从药材天麻花葶中提取到高质量的DNA，是成功构建DNA指纹图谱的前提。有效去除DNA所含的杂质(糖类、酚类等)，避免多糖、多酚、色素等影响DNA聚合酶的活性是获取高质量DNA的关键。近来植物总DNA提取的方法主要有两种：CTAB法和SDS法。由于本实验所选材料为新鲜天麻幼嫩的花葶，一是避免DNA分子发生降解，二是天麻花葶为新鲜幼嫩部分，为其生长点DNA含量高且次生代谢产物少，避免多糖及酚类杂质影响DNA的纯度和产率。故选用了操作简单、性质温和的改良的SDS法提取天麻基因组DNA。
1 材料与方法
1.1 仪器材料 DYY-8B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)、JUNYI电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像仪(Biorad公司)、Smartspec TM3000DNA浓度的测定仪(Biorad公司)。“S”提取液、TE缓冲液、苯酚：氯仿(1∶1)、氯仿∶异戊醇(24∶1)、氯仿、异丙醇、3mmol/L NaAc 10mg/ml RNase A。植物材料为兰科天麻(Gastrodia elata Blume.)新鲜花葶。以野生型天麻和种植型天麻为实验对象，编号分别为1、2、3、4、5(其中1、2为大方GAP栽培品乌天麻，3、4、5为野生品乌天麻)，由贵阳医学院王晓丽教授鉴定、提供。
1.2 方法
1.2.1 天麻基因组DNA提取 本研究在Edwards等(1991)［2，3］提取DNA方法的基础上，做了以下改进，具体操作步骤如下：(1)取新鲜和幼嫩的天麻花葶用70%的乙醇清洗表面，用灭菌去离子水冲洗干净；(2)放入预冷的研钵与液氮共研成细粉，取少许粉末加入1.5ml Eppendorf管中，迅速加入预热至65℃的“S”提取液750μl，经摇充分混匀，在65℃水浴中保温1～2h，其间颠倒混匀数次，取出，10000r/min离心10min；(3)加等体积的苯酚：氯仿(1∶1)，轻轻摇匀，10000r/min离心10min，转移上清液；(4)加等体积的氯仿溶液，混匀后，10000r/min离心10min，转移上清液；(5)加0.6倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀，于-20℃静置30min；(6)用枪头小心挑出絮状DNA，加150μl的70%乙醇冲洗2次；勾出的DNA，在通风橱中风干，加100～150μl 1×TE，溶解；(7)加3～4μl RNase A,37℃放置1～2h，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的去除情况，再加500μl1×TE缓冲液；重复(3)(4)过程，将(3)中的苯酚：氯仿(1∶1)用氯仿：异戊醇(24∶1)取代：取上清液加入1/10体积3M NaAc，混匀后，加入2倍体积的冰冻乙醇，于-20℃静置20min，沉淀DNA；加150μl 70%乙醇洗脱2次，勾出的DNA，室温风干；加50～300μl 1×TE溶液溶解DNA，4℃下保存。
1.2.2 DNA的质量检测 用0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙啶)染色，进行DNA质量检测，电泳缓解液为1×TAE，电压为80V，电泳1～2h，然后在紫外凝胶成像系统下观察摄像。
1.2.3 DNA的浓度检测 取2μl DNA溶液用1×TE稀释100倍，在核酸分析仪上，测定在260nm/280nm波长下的吸收值，根据A260/A280判断DNA纯度，A280值计算DNA产率。并计算OD值(A260/A280)，调整所有DNA的量至200～500ng/μl左右。
2 结果与分析
本试验采用SDS法提取天麻基因组DNA，SDS法操作简单，温和，可提取到较高分子量DNA，经DNA的质量检测显示，其分子量太小约23.2kb，点样孔不发亮，DNA主带清晰，无弥散带，无明显的RNA带，说明天麻的RNA、蛋白质、多糖以及其他次生代谢物质去除的比较干净，纯度较高(见图1)。经DNA的浓度测定显示DNA浓度在3.0mg/g以上，A260/A280值均在1.75以上(见表1)，说明质量较高。表1 DNA样品的浓度测定结果
3 讨论
3.1 天麻块茎含有大量的糖类、酚类以及蛋白质等物质，如果选用干品药材，由于老化和贮存时间较长，植物材料中多糖和酚类含量较高，从中提取得到的DNA，常会和多糖、酚类形成共沉淀而成胶冻状或黄褐色，严重影响了DNA的得率和质量。在天麻生活史中，大部分阶段都与蜜环菌共生，因此选择适当的阶段和部位对DNA的提取也很重要。由于初生块茎的皮层细胞内有蜜环菌，故用初生块茎提取DNA时，要去除蜜环菌，最好取生长点部位的组织，这样既可避免蜜环菌DNA污染，又可得到产量较高的DNA。新鲜和幼嫩的植物材料因其含有较完整的DNA，从天麻花葶的幼嫩部分提取DNA是最理想的部位。一方面花葶没有蜜环菌侵染，同时花葶又是形成花和花序的生长点部分，细胞中含有丰富的DNA。从该部分提取DNA，通常能获得产量高、质量好的DNA。但从花葶提取DNA，因受天麻生长季节的限制，通常只有当天麻开花时才能取材。
3.2 从不同的植物材料中获得基因组DNA只是在得率和纯度以及对后续反应的影响等方面有所差异，但因各方法本身具有不同的特点和优势，故针对不同的植物材料或同一样本的不同部位，应选择最适合的方法来应用［4～6］。本实验采用改良的SDS法提取天麻基因组总DNA。应用此方法并通过采用较大离心力和较长离心时间以及以异丙醇反复沉淀等步骤提取了片段较完整的基因组。
3.3 用0.8%琼脂糖凝胶电泳，EB(溴化乙锭)染色，进行DNA质量检测，所得的DNA主带清晰明亮，无弥散带，无明显的RAN带，说明RNA、蛋白质以及其他次生代谢物质去除的比较干净，DNA含量高，纯度较高，可用于进一步分析。
【参考文献】
1 Vos P.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting.Nucleic Acid Res,1995,23:4407.
2 Edwards K,Johnstone C,Thompson C.A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.Nucleic Acids Research,1991,19:1349.
3 Mc Donald MB,LJ,Elliot PM,Sweeney.DNA extraction from dry seeds for RAPD analyses in varietal identification studies.Seed Sci& Techol,1995,22:171-176.
4 李晓波，冯波，张朝晖，等.植物药材总DNA提取.中草药，2002，33(7)：652-654.
5 王景雪，孙毅，高武军.一种简便实用的植物总DNA提取方法.山西大学学报(自然科学版)，2000，23(3)：271-272.
6 Mizukami H,Okabe Y.A simple ang rapid protocol for preparation of crude drug DNA suitable for pcr.Biol Pharm Bull,1999,22:765-766.
基金项目：本研究由国家科技部2004BA721A33、贵州省科技厅黔科合农社字(2001)1125号、黔科合中药专字(2003)51号课题资助
作者单位： 550004 贵州贵阳，贵阳医学院药用植物学与生物学教研室
(编辑：邓 锋)