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【摘要】 目的 探讨大鼠实验性脑出血后早期不同时间注射红花注射液后，对血肿周围细胞凋亡及细胞凋亡相关蛋白等指标的影响。方法 将96只SD大鼠随机分成红花治疗组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治疗组。各组均于脑出血后第72h处死，取脑，连续切片做TUNEL染色和免疫组化染色。观察不同时间用药对大鼠神经功能评分、血肿周围细胞凋亡数目及凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2/Bax等指标的影响。结果 与出血对照组相比较，各药物治疗组的神经功能评分降低、Bcl-2/Bax蛋白比值增高、Caspase-3蛋白阳性细胞数减少、TUNEL阳性细胞数减少；红花注射液组在脑出血前24h和脑出血后0h给药治疗的Bcl-2/Bax蛋白比值低于脑出血后6、12、24h治疗组、Caspase-3蛋白阳性细胞数高于脑出血后6、12、24h治疗组；在大鼠脑出血后6h、12h、24h注射红花注射液，出血灶周围Caspase-3阳性细胞逐渐增多、Bcl-2/ Bax比值逐渐降低，出血后6h给药治疗组的TUNEL阳性细胞数低于出血后24h治疗组。结论 在不同时间给予红花注射液治疗脑出血大鼠，均能不同程度地促进脑出血大鼠神经功能的恢复，其中术后6h给药组治疗效果最好，其可能通过促进Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax和Caspase-3蛋白的表达，从而抑制血肿周围的细胞凋亡。
【关键词】 脑出血；细胞凋亡；红花注射液；大鼠
The effect of Safflor injection on cell apoptosis around the hematoma in the early time after experimental intracerebral hemorrhage in rats
MA Quan-rui,ZHANG Lian-xiang,SUN Jin-ping,et al.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China
【Abstract】 Objective To study the effect of Safflor injection on apoptotic cell and protein about apoptotic cell in the early time after experimental intracerebral hemorrhage （ICH）in rats.Methods 96 rats were randomly divided into the remedial group with ICH and the contrast group including ICH contrast group with ICH and normal contrast group without ICH. Then each group of rats were divided into five groups which were 24 hours remedial group before ICH of rats,0,6,12 and 24 hours remedial group after ICH of rats. All rats involved in the experiment were killed on the 72nd hour following ICH. The immunohistochemical method was performed in rat brain by using antibody caspase-3 or antibody bcl-2,bax. TUNEL method was used to detect apoptosis around the hematoma.Results Compared with ICH model group,Safflor injection could significantly alleviate neurological system damage symptoms,heighten the ratio of bcl-2/bax,and reduce the number of caspase-3 positive cell and the number of TUNEL positive cell around hematoma in ICH rats. The number of caspase-3 positive cell of Safflor group treated before ICH 24 hours ahead,after ICH 0 hour were more than that of Safflor group treated after ICH 6,12,24 hours. The bcl-2/bax of Safflor group treated before ICH 24 hours ahead,after ICH 0 hour were lower than that of Safflor group treated after ICH 6,12 or 24 hours. When the treated group were injected Safflor after ICH 6,12,24 hours,The number of caspase-3 positive cell around hematoma was gradually increased and the number of bcl-2/bax positive cell was gradually degraded and the number of TUNEL positive cell of Safflor group treated after ICH 6 hours were less than that of Safflor group treated after ICH 24 hours. Conclusions When Safflor injection is used earlier to cure ICH,it can decrease the rate of cell apoptosis and capase-3 protein expression,heighten the ratio of bcl-2/bax around the hematoma,especially in the Safflor group treated after ICH 6 hours.
【Key words】 intracerebral hemorrhage; apoptosis; Safflor injection;rat
脑出血是一种发病率、病死率和致残率均较高的临床常见病和多发病，迄今为止对脑出血的治疗虽较以往有很大进步，但脑出血仍具有相当高的死亡率。近年来，部分作者应用活血化瘀法治疗急性期脑出血取得了一定的疗效，但在治疗的时机上，特别在早期使用活血化瘀药治疗脑出血患者尚存在较大的争议。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SD大鼠雌雄不限（126只），体重230～280g，由宁夏医学院实验动物中心提供，动物合格证号（SCXK〈宁〉20050001）。
1.1.2 主要试剂 红花注射液（雅安三九药业有限公司，批号 070304），Ⅶ型胶原酶（sigma公司），TUNEL 检测试剂盒（Roche公司），Caspase-3多克隆抗体（武汉博士德公司），Bcl-2、Bax单克隆抗体（Sata Cruz公司），DAB染色试剂盒（北京中衫生物公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 将大鼠（雌雄对半）随机分成红花治疗组、出血对照组、正常对照组，各组又再分成出血前24h、出血后0、6、12、24h治疗组，各红花治疗组每日腹腔注射红花注射液1次，剂量为1.5ml/（kg·d），正常对照组和出血对照组组每日腹腔注射等量生理盐水1次。每日进行神经功能评分1次，各组大鼠均于脑出血后第72h处死。
1.2.2 脑出血大鼠模型制作 根据脑立体定位图谱于大鼠前囟后0.2mm，中线右侧旁开3.0mm钻孔，暴露硬脑膜。微量进样器吸取0.5u/μlⅦ型胶原酶和6.25u/μl肝素的混合液0.26μl，以硬脑膜平面为零点，缓慢进针，深度为5.0mm，缓慢注入药物，注射完毕后留针10 min，缓慢退出微量进样器，清洁伤口，缝合头皮，术后保温。
1.2.3 免疫组织化学染色 石蜡切片，采用SP法，DAB显色，光学显微镜下观察。于 200 倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在2、4、6、8、10、12六个时钟点中选择5个不重复视野区，计数阳性细胞数，计算平均值。
1.2.4 细胞凋亡的检测 取与免疫组化染色相邻切片,用末端脱氧核糖核苷转移酶介导的DUTP缺口末端标记法（TUNEL），DAB显色。于 200 倍光镜下在血肿周围按顺时针方向在2、4、6、8、10、12六个时钟点中选择5个不重复视野区，计数TUNEL反应阳性细胞数，计算平均值。
1.2.5 统计学处理 结果用x±s表示。统计学处理采用SPSS11.5软件包进行t检验、方差分析,显著性水准均为α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠神经功能缺损评分 麻醉苏醒后，模型组动物均出现不同程度神经功能缺损表现，根据Berderson评分标准对术后各组大鼠进行神经功能评分，各组评分情况见表1。表1 脑出血后各时相点神经功能评分注：notes:▲P<0.01，VS ICH group
2.2 免疫组化 Caspase-3蛋白表达以细胞浆或细胞核中呈棕黄色着色的颗粒为阳性细胞，Bcl-2和Bax 蛋白表达均以细胞浆呈棕黄色着色为阳性细胞，以神经元细胞表达为主，并且主要集中在血肿周围脑组织。正常对照组也可见到较少的Caspase-3蛋白、Bcl-2 蛋白和Bax 蛋白阳性细胞表达，但Bcl-2/Bax的比值始终接近1。
2.3 TUNEL染色 根据免疫组化的结果，选取差异显著的两个时间点进一步做TUNEL染色，TUNEL 阳性细胞以细胞膜周边染色质堆积染色呈棕黄色或细胞核着色呈棕黄色评判为TUNEL 阳性细胞。在血肿周边的外围，以神经元为主，少部分是神经胶质细胞和血管内皮细胞。ICH各组、各时间点凋亡细胞表达情况见表2、表3。表2 各药物在不同时间点给药时血肿周围Caspase-3、Bcl-2、Bax阳性细胞记数注:VS ICH group，▲P<0.01,VS 24 hours ahead remedial group,◆P<0.01,VS 24 hours ahead remedial group,★P<0.05,VS 0 hours remedial group，●P<0.01,VS 0 hours remedial group,■P<0.05表3 各组在术后6、24h给药时血肿周围TUNEL阳性细胞数注：▲P<0.01，VS ICH group
3 讨论
脑出血是一种严重危害人类生命健康的临床常见病和多发病。据统计，在我国脑出血占急性脑血管病（脑卒中）的40%～50%，是脑卒中死亡率最高的临床类型，脑出血后30天内病死率接近50%，许多存活者遗留明显的神经功能缺失。在治疗上目前临床上除运用传统脱水药、手术清除血肿外，治疗手段较少，无其他特效的方法［1］，且相当部分脑出血患者虽早期行血肿清除，但预后仍然不佳。千百年来中医中药在脑卒中的治疗得以广泛的应用，部分作者应用活血化瘀法治疗急性期脑出血取得了一定的疗效，但在治疗的时机上特别在早期使用活血化瘀药治疗脑出血患者尚存在较大的争议。
文献表明，细胞凋亡是脑出血后细胞死亡主要途径之一 ［2］。各种动物实验表明， 脑出血后4～6h细胞凋亡即开始出现，凋亡高峰在脑出血后48～72h［3］。另外，有研究表明：脑细胞缺血后先出现促凋亡基因表达，后出现神经元群体的凋亡，这就为治疗提供了时间窗，从理论上推测如果能在发病早期抑制促凋亡基因的表达或促进抑制凋亡基因的表达，就能有效地保护神经元细胞的损伤。
目前认为，哺乳动物的细胞凋亡至少由两条通路构成，即死亡受体通路和线粒体通路，这两条凋亡途径不是孤立的,后期的共同途径是Caspases的激活，其中caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，在细胞凋亡分子机制网络中居核心地位［4］。线粒体在多种凋亡途径中起到了核心作用［5］，在线粒体通路调节细胞凋亡中，Bcl-2基因家族是目前较为公认与之密切相关的基因。Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族中已被发现的与细胞凋亡关系密切的两种基因，是一对在功能上相互对立的细胞凋亡调控基因，在中枢神经系统中均有表达。Bcl-2和Bax是两类典型的抑凋亡和促凋亡蛋白， Bcl-2与bax结合成异二聚体是Bcl-2发挥抗凋亡活性所必需的［6］， Bcl-2/Bax异二聚体，可通过阻断细胞色素C的释放，抑制下游Caspase-3的激活，从而抑制凋亡的发生，即细胞内Bcl-2与Bax比例决定受凋亡信号刺激细胞的最终命运，Bcl-2/Bax值增加，细胞凋亡减少；反之，则诱发细胞凋亡机制的启动［7］。
脑出血后脑内血肿，中医认为离经之血即为淤血，治法也应活血化瘀。祖国医学认为血瘀是中风的本质，活血化瘀是治疗中风的根本大法，但在治疗时机上存在较大争议。有作者认为活血化瘀不论在早期先驱症状、发作期，还是恢复期均可应用。特别提出，在急性脑血管疾病中，控制出血不是采取止血方法，而是应用活血止血、化瘀止血、理气止血等法。
红花作为一种应用普遍的强活血药，临床广泛应用于脑中风的治疗。现代药理研究显示红花具有:扩张血管、降低血压［8］；抑制血小板活化因子诱发血小板聚集、释放及血小板内游离钙浓度升高；抑制诱发的人中性粒细胞聚集、粘附［9,10］，提高大鼠的纤溶性［11］；抑制缺血脑线粒体膜流动性的降低、线粒体肿胀、脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和降低细胞色素氧化酶活性；抑制Ca2+过多摄入，改善线粒体呼吸功能，拮抗氧自由基［12］。
众多的医家使用活血化瘀药多在脑出血的亚急性期（3天或3天以后）。况时祥［13］认为活血化瘀药在脑出血急性期的主要作用还在于改善由出血而引发的血液循环障碍，减轻脑组织的缺血缺氧损伤，而并非消除血肿或减轻脑水肿，反对一味寻求促进血肿清除的峻猛之药,并指出脑出血在使用活血化瘀保持谨慎态度，防止再出血，认为发病后6～24h内应为应用活血化瘀类药的最佳时机。
本实验的研究结果显示：（1）实验性ICH后不同时间点使用红花注射液治疗均有效果。（2）6h治疗组和12h治疗组治疗效果优于其他组。从行为学表现来看，从术后6h开始对大鼠进行神经功能评分，各治疗组神经功能缺失症状明显轻于出血对照组，但各治疗组组间比较无差异。从凋亡相关蛋白表达情况来看，各治疗组均能减少脑出血后的出血灶周围凋亡蛋白Caspase-3的表达，升高Bcl-2/Bax的比值，与出血对照组相比较差异有显著性（P<0.01），且出血灶周围Caspase-3、Bax蛋白的表达情况与TUNEL染色结果相一致。正常对照组组的Bcl-2/Bax的比值接近于1。对本实验不同时间用药的结果进行分析表明，在大鼠脑出血后6h以前给红花注射液治疗，与大鼠脑出血后6h以后给红花注射液治疗相比较出血灶周围Caspase-3阳性细胞明显增加、Bcl-2/Bax比值明显降低，提示红花注射液在脑出血后6h以前用药效果不理想，可能与红花注射液在出血同时给药时抑制血小板聚集［9］，加重脑出血有关。从TUNEL阳性表达情况来看，红花术后6h治疗组和红花术后24h治疗组凋亡率低于出血对照组，并且红花术后6h治疗组较红花术后24h治疗组血肿周围TUNEL阳性细胞数有所减少，但差异无显著性（P>0.05）。在大鼠脑出血后6、12、24h注射红花注射液，出血灶周围Caspase-3阳性细胞逐渐增多、Bcl-2/ Bax比值逐渐降低，与TUNEL染色结果相一致，提示红花注射液在大鼠脑出血6h以后尽早用药效果比较理想，与文献［14］报道一致。推测其可能与通过促进Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax和Caspase-3蛋白的表达，从而降低血肿周围凋亡细胞的表达有关。另外在本实验中，在大鼠脑出血后0h给予红花注射液治疗，有1例血肿周边见可到新鲜出血灶，说明出血6h以内应慎用活血化瘀药物来治疗脑出血。但在脑出血后康复治疗阶段应用红花注射液治疗脑出血的效果如何有待进一步的研究。
综上所述，红花注射液早期治疗实验性大鼠脑出血可明显减少血肿周围的细胞凋亡率，脑出血6h以内应慎用活血化瘀药物来治疗脑出血，脑出血6h以后尽早用药效果较理想。
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13 况时祥. 活血化瘀药治疗脑出血急性期探要. 中医药学刊,2004,22（8）：1513-1514.
14 陈汝兴. 应加强脑血管疾病活血化瘀治疗的研究. 中国中西医结合急救杂志,2000,7（3） ：131-132.
作者单位：宁夏银川，宁夏医科大学基础学院人体解剖学教研室（△通讯作者）