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基因缺陷动物模型促进药物跨膜转运研究

来源:《中国医药报》
摘要:药物膜转运蛋白是存在于细胞膜上的在药物吸收、分布、排泄中起重要作用的一类蛋白,利用膜转运蛋白的性质来增加药物吸收、改变药物分布或排泄性质,可达到增加药物疗效或减少药物不良反应的目的。基因缺陷动物模型是目前研究膜转运蛋白功能的重要手段之一,分为先天遗传性基因缺陷模型和基......

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  药物膜转运蛋白是存在于细胞膜上的在药物吸收、分布、排泄中起重要作用
的一类蛋白,利用膜转运蛋白的性质来增加药物吸收、改变药物分布或排泄性质,
可达到增加药物疗效或减少药物不良反应的目的。基因缺陷动物模型是目前研究
膜转运蛋白功能的重要手段之一,分为先天遗传性基因缺陷模型和基因敲除模型。
其中,基因敲除技术是19世纪80年代后半期应用DNA同源重组原理和胚胎干细胞
(ES细胞)分离和体外培养发展起来的一门新技术,是指对一个结构已知但功能
未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其他顺序相近的基因
取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。近年来,利用基因缺陷
动物模型研究膜转运蛋白取得了快速的进展。
  ■mdr1a基因敲除小鼠模型
  P糖蛋白(P-gp)是一种ATP能量依赖性的药物外排转运体,有关P-gp在多药耐
药性方面的作用研究已进行了多年,其中大多数实验成果归功于对P-gp基因敲除
小鼠模型mdr1a(-/-)的利用。目前已发现的人类P-gp基因有两个成员,即MDR1和
MDR2;在啮齿类有3个成员,即mdr1a、mdr1b和mdr2。研究表明,MDR1、mdr1a和
mdr1b基因参与多药耐药。P-gp一旦与药物结合,则通过ATP提供的能量,将药物
从胞内泵出,使药物在胞浆内的浓度逐渐降低,从而导致药物作用减弱或消失,
这是许多抗癌药物出现耐药现象的主要原因之一。
  为了深入研究P-gp的功能和对药物转运的影响,荷兰肿瘤研究所的Schinkel
等用转基因技术建立了mdr1a(类似人的MDR1)基因缺失小鼠,称mdr1a(-/-)小鼠。
mdr1a(-/-)小鼠没有明显的生理缺陷,并可繁殖。mdr1a(-/-)小鼠在肠道不表达
P-gp功能,此种小鼠不用P-gp抑制剂时,若药物有转运,就可肯定此药物为非P-
gp转运。此模型可以真实反映药物跨膜的被动吸收,在与野生型动物实验对比时
又能快速定位P-gp蛋白。
  该模型已用于研究P-gp的作用及其在小鼠全肠中的表达部位,并尝试性地用
于寻找P-gp是否对外源性物质的肠上皮被动转运有决定性作用。在mdr1a(+/+)小
鼠中,紫杉醇从黏膜层向基底层转运时,转运很少且各肠段差异不大。而在mdr1
a(-/-)小鼠中,其吸收有很大提高,差异变大,结肠末端的吸收比在野生型鼠中
高出5倍,远端空肠和近端回肠高出两倍。比较紫杉醇在两种鼠中的外排情况,
野生型鼠显示出其在各肠段分泌的显著变化,分泌最多的是回肠和结肠远端,最
少的是空肠和结肠近端。相反,从基底层向黏膜层转运时,在mdr1a(-/-)小鼠中
紫杉醇的分泌被完全抑制。由此表明,P-gp在肠中是紫杉醇惟一的外排调节蛋白,
敲除P-gp基因可以显著显示此药物的被动转运有部位依赖性。
  ■Mdr2基因敲除小鼠模型
  实验证明,抑制胆管糖蛋白转运体可以引起家族性胆汁郁积症。MDR3基因突
变可以诱导3-型家族胆汁郁积症。小鼠中mdr2基因突变就类似于人类的MDR3缺陷
症。破坏mdr2基因和用CsA(环孢素A)抑制糖蛋白转运体都可以导致小鼠胆汁郁
积症,其表现为胆汁流量减小,胆汁和胆脂质分泌减少。但CsA不会明显增加mdr
2基因敲除小鼠的胆汁郁积症状。牛黄胆酸可以减少mdr2基因敲除小鼠和用CsA抑
制糖蛋白转运体的小鼠的胆汁郁积症状。
  ■Mrp1基因敲除小鼠模型
  Mrp1蛋白与P-gp同为ATP结合的盒式膜转运蛋白家族成员。Mrp1主要的生物学
功能包括:(1)保护机体免受环境中存在的氧化态重金属阴离子的伤害。Braman等
研究表明,小鼠Mrp1(-/-)细胞株较正常小鼠Mrp1(+/+)对氧化态重金属阴离子的
敏感性增加。由挪威放射医院Rappa等做的类似实验结果出现在Mrp转染的细胞系
中,但未在体内实验中重现此结果,原因可能是重金属毒性作用的重要靶器官—
—肝脏在正常生理条件下低表达Mrp,干扰Mrp表达并不影响肝脏对重金属的解毒
功能。(2)调节离子通道活性。加拿大女皇大学的Jirsch等报道,表达Mrp1的细
胞株伴钾离子通道和浓度调节的氯离子通道电流增加,改变Mrp1的表达水平时也
发现有内向的钾离子通道开放,但在Mrp1基因敲除小鼠的胚胎干细胞中,并没有
出现支持这一结论的实验结果,提示离子通道的调节可能存在着种属差异。
  ■Mrp2先天性基因缺陷大鼠模型
  Mrp2是一种多药耐药相关蛋白,它不仅在药物胆排泄中起着重要的作用,也
和多种药物的耐药有关。Mrp2基因缺陷动物模型目前常用的有两种,即hyperbi-
lirubinemic Groningen Yellow/TR-(GY/TR-)及Eisai hyperbilirubinemic
(EHBR)两种大鼠。它们分别从Wistar和SD大鼠变异而来。有机阴离子的胆汁分泌
被Mrp2调节,通过比较正常鼠和Mrp2缺陷鼠药物的跨胆小管膜分泌可以来确定
Mrp2的底物,这些模型还可以很好地研究人类Dubin-Johnson综合征的发病机理。
通过模型动物的实验结果显示,Mrp2底物包括谷胱甘肽、葡萄糖醛酸结合物和游
离有机阴离子。
  EHBR大鼠模型此模型为先天缺失胆管Mrp2的一种SD大鼠。为了研究胆酸结合
药物的胆管分泌,研究人员用血栓素A2(TXA2)受体拮抗剂Z-335及其胆酸结合
物Z-335-Tau进行跨胆管膜转运实验,发现Z-335在胆管通过Mrp2排泄,但是Z-3
35-Tau进入胆汁不是通过Mrp2,而是其他ATP依赖性的转运体。通过利用Mrp2基
因缺失动物实验,还可发现大环内酯类抗生素阿奇霉素以及药物的硫酸结合物也
是Mrp2的底物。
  GY/TR-大鼠模型GY/TR-大鼠通过Wistar大鼠的基因突变得来,在肝实质细胞
膜上不表达Mrp2,可以在功能水平上对肝部转运机理提供很好的研究。该模型常
用来鉴定Mrp2的底物,主要研究范围是谷胱甘肽结合物、葡萄糖醛酸结合物、硫
酸结合物及其他两性离子的胆汁分泌。
  Mrp2在肾近曲小管细胞膜上有表达,但过去很少有其参与药物肾脏排泄的报
道。荷兰内梅亨大学医学院的Rosalinde研究了Mrp2在肾脏中的作用,他用Mrp2的
底物calcein与fluo-3分别对Wistar Hannover和TR-大鼠模型进行离体肾脏灌流,
结果发现,calcein和fluo-3在TR-的肾脏分泌率低于Wistar Hannover大鼠。Mrp
2底物calcein和fluo-3的肾脏清除率在TR-大鼠显著减少,从而使人们认识了Mrp
2在肾排泄中的作用。
  基因缺陷动物模型在药物跨膜转运研究中发挥了很大的作用,但目前也存在
模型较少、供货渠道单一和价格较高的问题,从而限制了其使用。相信随着人们
对膜转运蛋白作用研究的重视,会出现更多类型的药物转运蛋白基因缺失动物模
型,加快人们在药物转运领域的研究步伐。
□何卉 陈西敬 王广基


作者: 2006-9-21
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