采用有效TaqMan探针和抽提病毒DNA进行实时PCR快速定量乙型肝炎病毒DNA

2007年02月07日 World J Gastroenterol. 2006 Dec 7;12(45):7365-70. 19 为快速定量乙型肝炎病毒(HBV)DNA，采用有效TaqMan探针和抽提病毒DNA进行实时PCR，研究人员将分别靶向pGEM-T 载体的HBV染色体S, C 和X区域克隆PCR产物制备三个标准体，比较源于三种不同标准曲线血清样本HBV的拷贝数和Ct值以选择一系列引物和匹配的TaqMan探针，采用实时PCR分析样本A, B 和C中六种HBV DNA抽提方法的效率，包括异硫氰酸胍、蛋白酶K、NaI、NaOH裂解法、碱裂解法以及简单煮沸法。同时，量化8个临床HBV血清样本。结果可见，源于S, C 和X标准曲线的HBV血清样本的拷贝数分别为5.7*10(4)/mL，6.3*10(2)/mL和1.6*10(3)/mL，Ct相对值分别为26.6, 31.8 和29.5。因此，选择引物和匹配的探针S区域以进一步优化六种抽提方法。NaOH裂解法中，HBV血清样本A, B 和C的拷贝数分别为3.49 *10(9)/mL, 2.08 *10(6)/mL 和4.40 *10(7)/mL，Ct相对值分别为19.9, 30 和26.2，这种方法在六种中效率最高。简单煮沸法显示效率稍低于NaOH裂解法。异硫氰酸胍、蛋白酶K和NaI显示HBV血清样本A, B 和C的拷贝数约为10(5)/mL，同时Ct值约为30。碱裂解法不能定量三个HBV血清样本的拷贝数，8个临床HBV血清样本标准差(SD)和变异系数(CV)较低，提示三份量化的HBV DNA比较可靠和精确。因此，基于优化的引物和TaqMan探针S区域的实时PCR联合NaOH裂解法是简单快速和精确的量化HBV血清 DNA的方法。