重组人溶菌酶和牛乳铁蛋白N末端多肽基因表达及其活性研究项目通过鉴定

2006年06月14日 教育部科技发展中心 10 近日，由中国农业大学承担的重组人溶菌酶和牛乳铁蛋白N末端多肽基因表达及其活性研究项目通过了教育部科技发展中心组织的鉴定。据了解，该研究取得了以下的成果：1、通过RT-PCR反应，克隆了人溶菌酶的cDNA序列，经序列分析证明与已发表的序列完全一致。构建出重组表达质粒pPIC9K/hLZM和1 200株毕赤酵母重组表达菌株KM71/hLZM。通过G418筛选，共得到15株高拷贝毕赤酵母重组表达菌株KM71/hLZM。通过甲醇诱导表达，获得1株能高效分泌人溶菌酶的表达株Pp135，其最初表达产量为317mg/L，酶活性为32 035u/mL。通过培养基筛选试验，表明BGMY/BGMM、BGM/BMM、MGY/MMC等培养基均能诱导菌株表达人溶菌酶。为今后生产节约成本、便于人溶菌酶的纯化，本研究确定以培养基BGM/BMM培养和诱导菌株Pp135。通过研究确定诱导条件为：将100mL BGM培养物，以50mLBMM进行诱导表达，诱导温度为30℃，摇床设定为250rpm，诱导表达5天结束。其表达量为381mg/L。2、选择鲁西黄牛肝脏提取gDNA, 根据已知的基因序列克隆了牛乳铁蛋白N末端多肽162 bp目的基因片段，经测序分析验证后成功地构建到表达载体中，得到重组表达质粒pGEX-4T1/rbLF-N和重组表菌株BL21/rbLF-N，通过IPTG诱导后成功表达，表达的融合蛋白占总的菌体蛋白的20.4%。对重组融合蛋白pGEX-4T1/rbLF-N 包含体通过复性和纯化，确定了复性最佳的复性条件为 pH 值为 8.5，蛋白溶液浓度为 100 μg/mL 和 DTT 浓度为 24 mmol/L；亲和层析后的目的蛋白纯度为93.23 %；对重组牛乳铁蛋白N末端多肽进行了陶瓷膜和发酵罐技术中试研究，多肽的产率达到2.2 g/L。用 0.4 % 的重组人溶菌酶和 1 % 的重组牛乳铁蛋白N末端多肽对生猪肉进行了抗菌保鲜试验。3、该研究首次建立了牛乳铁蛋白 N 末端多肽（外显子2）在大肠杆菌中的重组表达体系，获得了高效表达牛乳铁蛋白 N 末端多肽菌株和高效分泌人溶菌酶的菌株。3、首次对重组牛乳铁蛋白 N 末端多肽（外显子2）进行了复性和纯化研究，确定了最佳复性条件，纯化后的目的蛋白纯度达到 93.23 %。4、首次用陶瓷膜和发酵罐技术对重组牛乳铁蛋白N末端多肽进行了中试研究。获得的重组牛乳铁蛋白N末端多肽的产率达到2.2 g/L。5、首次用凝血酶和胃蛋白酶酶解重组牛乳铁蛋白 N 末端多肽并测定了酶解产物的抗菌活性，抗菌效果比报道的化学合成的牛乳铁蛋白肽高。用 0.4 % 的重组人溶菌酶和 1 % 的重组牛乳铁蛋白N末端多肽对生猪肉进行抗菌保鲜试验，效果显著。