破除法老DNA的咒语

DNA储存在细胞核内，生物体在死亡过程中，细胞会逐渐发生自溶，大量酶类如蛋白酶、DNA酶等释放，细胞的DNA很快会被降解，即便是细胞没来得及自溶，但是天长日久，微生物进驻组织或细胞，就像寄居蟹一样，在那里吃喝拉撒、生老病死，它们产生的酶类也会把原细胞内的DNA破坏掉，一般死亡的动物和人的遗体，DNA很难完整保存下来。最终技术的进步打破了这个咒语，研究人员成功地获得图坦卡蒙的DNA，也成功地得到了各个木乃伊的DNA指纹图谱。



古埃及法老（国王）的尸体都被做成木乃伊，保存在金字塔里，据传说，冒犯了法老王的干尸，就会中法老的咒语。在美国电影的渲染下，这个咒语被传得充满玄机，神秘莫测。似乎在埃及北部第六代塞加拉王朝的法老墓外，或内侧出现类似“咒语”的文字，据说也只是针对祭司的，好让其尽职保护墓地，而非防盗墓贼设定的神秘“咒语”或机关。考古学家其实并未在法老墓内发现任何咒语。



既然法老的咒语不一定有，那也就不存在打破一说。不过，法老的DNA却是一个实实在在的技术上的“咒语”，这一咒语让国际考古学界分成两派，闹得剑拔弩张，大有老死不相往来之势。大家的分歧主要在于古生物化石或遗体中的DNA能不能用来做考古鉴定，最终，还是技术的进步打破了这个咒语，如今两派也该抛弃成见握手言和了吧。



“恐龙蛋基因”的闹剧



故事要从上个世纪80年代说起。



1983年，美国人Kary  Mullis，当时还是加州一家公司的普通技术人员，发明了聚合酶链式反应（polymeras  chain  reaction,  PCR）,  简称PCR，用来扩增DNA。这项技术突破了分子克隆的技术瓶颈，让分子生物学的研究与应用都进入快车道，它的巨大价值显现立竿见影，也很快拿到了诺贝尔化学奖（1993年）。PCR技术刚一出现，一些考古研究人员就敏感地意识到，他们可以用这项技术从极少的古遗骸样品中扩增DNA，用于考古鉴定。瑞典乌普萨拉大学一个年轻的博士生斯文特·帕玻（Svante  Pbo），在导师的支持下，成了第一个吃螃蟹的人，他声称从2400年前的木乃伊中克隆出了DNA。于是乎，这项技术迅速被传开，一时发现各种古生物遗骸或化石DNA的报道纷纷出炉，令大家亢奋不已。  



那场古生物DNA克隆热很快降温，似乎成了一场笑话。后来分析发现，那些克隆出来的所谓恐龙基因片段，有些是环境微生物的基因片段，有些是说不清来源的基因，也就是说，可能都是污染信号。这下糗大了。一段时间内，“恐龙蛋基因”在生物学圈内成为大家调侃的谈资。



这个污染问题不是某个研究组单独遇到的问题，是当时的认识局限和技术条件下这个领域都遇到的共同问题。因为当时也有其他的国外研究组报道克隆了恐龙的基因，分析结果表明“恐龙属于现代人，因为基因序列一样”。这显然是极其荒唐的结论。



DNA检测中的“防噪”



怎么会有污染呢？



有点分子生物学经验的人可能都明白，PCR反应对原始信号是个指数扩增放大反应，极其敏感，理论上可以检测到一个DNA分子片段！但是这里有一个信噪比的问题。空气中的尘埃，甚至样品附着的尘土、微生物等，都是周围污染DNA的来源，这些DNA比较新鲜，无论是质量还是数量都会超过古老DNA（如果还残存），构成高强度的“噪声”。古老DNA的信号完全淹没在污染DNA噪声的海洋里，你看到的究竟是信号还是噪声？  有过在实验室从事分子生物学研究经历的朋友可能会问了：我们不也经常从基因组的海洋中用PCR“钓”取某个基因吗？那信号与噪声比不是也大得不得了吗？那其实不一样。为什么呢？用PCR克隆（钓取）基因需要引物，就像钓鱼时用的饵；一般研究中“钓”取一个基因用的常常是特异性引物，也就是你这个饵是专为要钓的这种鱼定制的，只有这种鱼爱吃，其他鱼不感兴趣；而从化石或遗骸中克隆基因就完全不同了，因为我们对其基因的信息一无所知，一般用的也是不太特异的引物，如简并引物或随机引物，就像我们对要钓的鱼的食性还不熟悉，只能用通用的饵料；如果水中尽是其他野鱼，你要钓的鱼快要灭绝了，或是在某个角落奄奄一息，你钓着它的可能性会有多大呢？  



这场失利对DNA测序用于考古鉴定可是一个沉重的打击。大家总是以异常挑剔的眼光去评判。



在考古生物学领域内，就古生物遗骸能否进行DNA鉴定问题，很快就分成了水火不相容的两派。挺DNA派似乎过于乐观，认为没问题，甚至可以作为常规；而反对一派则认为完全不可能，对待凡涉及DNA分析的论文，他们都百般挑剔，批评严厉，使其根本无法发表。认识上的对立不知不觉地演变成派别斗争，两派干脆连发表论文的杂志都分开了，似有“井水不犯河水，老死不相往来”的架势。



遗体很难完整保存DNA



古生物遗骸中的DNA究竟能不能克隆和进行测定？  这确实是个难题。生物学界冷眼旁观，似乎普遍不看好，为什么呢？



先来介绍一下DNA。我们的基因信息就存放在DNA里。DNA就像两股绳子，主体骨架是由一个个5-碳糖通过磷酸二酯键连起来，每一个糖上带着个小挂件——碱基；两条链间的碱基一一对应互补，靠氢键维持配对关系。有分子生物学实验经验的人一般会感到，DNA相对还是比较稳定，实验室提取的DNA可以在溶液中放置数周；如果零下20℃可以保存数月到1年；如果除去水分，晾干保存，可以放置数年或更长的时间。我们知道，实验室提取的DNA一般都经历一步酚氯仿抽提（或萃取）过程，这两个有机溶剂都是强烈的蛋白变性溶剂，目的是将所有酶类灭活。这就容易理解为什么实验室提取的DNA那么稳定了，一是除掉了攻击它的的酶，二是除去水分。尽管如此，但我们还是心存疑惑：即使是这样处理，能放置几千年吗？没人知道，更何况标本中的DNA可不像实验室提取和保存得那么安全。



在自然条件下，DNA确实不是那么安全的。DNA储存在细胞核内，生物体在死亡过程中，细胞会逐渐发生自溶，大量酶类如蛋白酶、DNA酶等释放，细胞的DNA很快会被降解，即便是细胞没来得及自溶，但是天长日久，微生物进驻组织或细胞，就像寄居蟹一样，在那里吃喝拉撒、生老病死，它们产生的酶类也会把原细胞内的DNA破坏掉；另外，在高温和潮湿的条件下DNA自身容易发生水解、断裂，因此，一般死亡的动物和人的遗体，DNA很难完整保存下来。当然，酶对DNA的破坏作用是需要水分的，而且跟温度成正相关，如果能保证绝对干燥，或许能保存得相对时间长些。另外，在个别特殊情况，如在极端寒冷的情况下被冻死的人或动物，这些组织来源的DNA或许能避免降解，或发生得极其慢，或许还有机会测得其DNA序列。



但是，对于古埃及的木乃伊，似乎有些特殊。木乃伊的制作过程显然对DNA的保存十分有利。首先，在人死亡之后尸体周围加大量的天然的盐类，包括碳酸钠盐类，使尸体快速脱水、变干，减少DNA的降解，避免自发水解；然后尸体上覆盖一层防腐剂，外层再涂上厚厚的隔离材料，主要由沥青、植物油和蜂蜡等制成，主要作用是防潮和防止空气氧化。上述涂抹材料都深深地渗入尸体内部，组织都被染成了黑色，这些材料其实对尸体的DNA形成特殊的保护。当然，这还只是理论推测，究竟如何，要看实际结果。



挺DNA派的一些考古学家有股“咬定青山不放松”的劲，坚持不懈，想方设法寻找解决问题的办法，其中就包括那个第一个吃螃蟹的人：斯文特·帕玻；当然，也有些彻底放弃了。此后，考古DNA测序也经历了沉沉浮浮、起起落落，此处不做细表。经过了多方尝试，条件优化、方法改进，其实始终难以获得理想的结果，难逃对手激烈的批评。



提取法老DNA



2008年，事情开始出现些转机，这要归功于埃及官方批准的一项“图坦卡蒙（古埃及法老）研究项目”。在埃及，大概到处都是木乃伊，但是质量参差不齐，而这次供研究用的可是王家木乃伊。既然是王家木乃伊，那制作技术水平应该是最高的，保存也应该是最完好的。在国际同行的合作参与下，对公元前1400年左右古埃及法老图坦卡蒙和周边几个金字塔内其他的10名王室成员进行了DNA指纹分析，当然也结合了其他常规的考古分析方法。这次研究规模浩大，据说全程摄像机追踪。



为了排除或降低污染的可能，科研人员们做了充分的准备。首先，实验室条件，已经远非当年简陋条件可比，如今已经采用高标准的空气层流实验室，也就是说，实验室内的空气全都是经过专门的过滤，做到无尘、无菌。据说当时电视台摄影记者进入实验室拍摄内景，他们走后实验室人员花了两个星期进行清洁，恢复到正常工作状态的洁净条件。第二个措施是，他们准备从骨腔内取组织，提取DNA，进行分析，这样最大限度地排除了标本中残存的外界灰尘、细菌等DNA的污染。他们提出了DNA，进行了DNA指纹分析，相当于现在做亲子鉴定所用的那一套方法。研究人员成功地获得DNA，也成功地得到了各个木乃伊的DNA指纹图谱，根据图谱，结合其他考古证据，研究人员描绘出了这个王室的五世家谱。根据以前考古获得的认识，图坦卡蒙是埃及历史上的年幼法老（国王），19岁就驾崩，究竟死因是什么？通过这次DNA指纹分析，科研人员提出了一个新的想法：图坦卡蒙可能死于疟疾，因为从他的DNA中发现有疟原虫的DNA。为了排除污染的可能，他们在不同的实验室由不同的人员进行独立重复提取DNA，结果十分一致。如果是由于污染，那么不同实验室来源污染的类型可能会有所不同。这些研究成果以报告论文形式发表在2010年《美国医学协会杂志》的发现专栏上。尽管做了严格的对照，甚至多方独立重复，但是，仍然难逃对手的批评和质疑。批评的问题主要集中两点：1）不能排除是被现代人污染了的DNA;  因为古埃及人的DNA和现代人没有多大区别。2）用的只是DNA指纹分析，给的信息太粗糙，还不足以说明问题。这些质疑和批评意见还发到了著名的杂志《自然》上，这让被批评的研究人员深感委屈。



古DNA“咒语”被破除



事情出现真正的转机还是有赖于第二代测序技术的出现和及时应用。



木乃伊保存得再完好，也不可能让DNA保存完整无损，就像我们马王堆出土的“帛”，其实已经脆弱不堪，很多已经是碎片了。常规测序需要基因片段达到一定长度，一般最佳为600-800个核苷酸这么长，最低也要上百个核苷酸，显然古DNA标本满足不了这个要求。新一代测序技术对DNA长短要求减低了很多，只要大于35个核苷酸就可以;  另外,对DNA量的要求也比较低，整个基因组测下来，几个微克DNA就够了。新技术大大降低了对DNA材料质量和数量要求的门槛，使得古DNA样品测序真正成为可能。



2010年，这项新技术终于在古DNA分析鉴定领域开花结果，古DNA测序这个“咒语”终于被破除。4000年前古爱基斯摩人的全基因组序列被测定；当年第一个吃螃蟹的人，斯文特·帕玻博士，也率领他在德国马普所的进化考古团队成功测定了38000年前尼安特穴居人和南西伯利亚一个前所未知的新人种的全基因组序列。这两项研究结果对现代人的起源带来了崭新的认识；与此同时，也终于以清晰和无可争辩的结果令对手无话可说，毕竟科学相信证据，无论任何立场和偏见，但在坚实可靠的科学证据面前都要低下傲慢的头。



技术推动科学，技术弥合了分歧，学术隔阂就像柏林墙一样顷刻倒塌。



有道是，浪花淘尽英雄出，吹去黄沙始见金。



■（作者系第四军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室教授，主要研究方向DNA损伤修复机制,靶向性表观遗传学修饰。）